枸杞子治疗骨质疏松症的分子机制

李秋江 房晓敏, 王胤斌, 胡学华 郭东更, 吕金捍, 蔡利军,*

1.宁夏医科大学第三临床医学院(宁夏回族自治区人民医院)，宁夏 银川 750002 2.西北民族大学第一临床医学院(宁夏回族自治区人民医院)，甘肃 兰州 730000

枸杞子是宁夏枸杞的干燥成熟果实，最早出现于《神农本草经》里面，主要的功效是滋补肝肾、强筋健骨。多项研究[1-2]表明枸杞子具有抗氧化、抗癌、抗炎等药理活性。动物试验[3]证实枸杞子中的多糖成分能够增加骨质疏松大鼠的骨密度，同时能够通过促进大鼠中一氧化氮合成酶(NOS)和转化生长因子-β1(TGF-β1)表达发挥调节骨代谢的作用。同时枸杞子也最早被我国“药食两用”的名单收录，既是传统中药材同时也能用作于保健产品[4]。因此，探究枸杞子有效成分治疗骨质疏松症的作用机制具有重要意义和临床价值。

网络药理学通过利用生物信息学分析，从药物活性成分、潜在作用靶点及信号通路等分子水平方面研究药物药理学作用机制，一定程度上解决了中药组方成分多样、研究复杂的困难[5]。但是关于枸杞子治疗骨质疏松疾病的研究仅仅停留在分子水平，未对其有效成分及基因水平的机制进行研究报道。因此，本研究基于网络药理学探究枸杞子在治疗骨质疏松疾病的作用机制，为枸杞子在治疗骨质疏松疾病方面的进一步研究提供一定的参考。

1 资料与方法

1.1 数据库及软件资源

本研究所运用的数据库及软件资源见表1。

1.2 方法

1.2.1枸杞子有效成分筛选和靶点预测：通过TCMSP分析平台检索枸杞子药物的全部化学成分，利用成分的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和药物相似度(drug likeness，DL)对枸杞子药物有效成分进行筛选(OB≥30%和DL≥0.18)。采用TCMSP分析平台对枸杞子相关有效成分作用靶点进行预测。

1.2.2枸杞子有效成分作用靶点的基因名一致化：由于部分药物潜在靶点不能在UniProt数据库中查询到，因此本研究需要对不能够匹配到的基因进行剔除，同时对能够匹配的基因名进行一致化。

1.2.3枸杞子有效成分与作用靶点网络图：将筛选得到的枸杞子有效成分作用靶点进行一致化、去重后获得枸杞子潜在作用靶点，将靶点导入Cytospace软件中构建药物有效成分-靶点作用网络图。

1.2.4寻找骨质疏松疾病靶点：分别利用OMIM、Drugbank和Genecards三种数据库，以“osteoporosis(骨质疏松)”作为关键词检索疾病靶点基因，剔除检索结果中重复的靶点基因，取并集得到骨质疏松疾病靶点基因。

1.2.5“枸杞子-骨质疏松”药物疾病交集靶点对应的有效成分：通过venn(韦恩)图确定“枸杞子-骨质疏松”药物疾病交集基因以及对应的有效成分，通过SymMap数据库查询有效成分的CAS号。

1.2.6构建交集靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络：将枸杞子-骨质疏松交集作用靶点导入STRING数据库中，种属选择人，最低要求互作分值(minimum required interaction score)设置为0.4，隐藏无相关联系的节点，最终得到交集靶点的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interacton，PPI)网络。将枸杞子-骨质疏松交集作用靶点导入STRING数据库中，种属选择人，最低要求互作分值(minimum required interaction score)设置为0.4，隐藏无相关联系的节点，最终得到交集靶点的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interacton，PPI)网络。

1.2.7“枸杞子-骨质疏松”核心靶点基因筛选：将交集靶点的PPI作用网络结果以文本形式导入Cytosapce软件中，利用cytohubba插件基于MCC、MNC、Degree三种算法计算节点分值，分别选取前20位显著性基因并取并集即可得到核心基因。

1.3 GO和KEGG分析

通过Metasacpe数据库对枸杞子与骨质疏松的核心靶点进行基因本体(gene ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。GO功能分析主要描述核心靶点的功能，KEGG通路富集分析可以得到核心靶点富集的信号通路。而后使用OmicShare云平台和R语言软件对上述的富集结果进行可视化绘图。

2 结果

2.1 枸杞子主要有效成分筛选结果

通过TCMSP分析平台对枸杞子有效成分进行筛选和靶点基因预测，同时运用UniProt数据库对靶点基因一致化，剔除重复靶点基因信息，共获得枸杞子中主要有效成分36个(表2)，潜在靶点163个。运用Cytospace软件构建枸杞子“有效成分-靶点”网络图(图1)。

表2 枸杞子中主要有效成分的基本信息

图1 枸杞子的成分-靶点网络图Fig.1 Composition-target network diagram of Lycii Fructus注：三角代表枸杞子有效成分；椭圆代表枸杞子作用靶点。

2.2 枸杞子靶点基因与骨质疏松疾病基因交集

利用OMIM、Drugbank和Genecards三种数据库取并集获得骨质疏松相关靶点基因4 137个，通过韦恩图找到枸杞子与骨质疏松的交集靶点基因117个(图2)。交集靶点基因所对应的枸杞子药物主要成分见表3。

表3 共同靶点对应枸杞子主要有效成分列表(Top 5)

图2 枸杞子与骨质疏松疾病靶点韦恩图Fig.2 Venn diagram of Lycii Fructus and osteoporosis disease targets

2.3 PPI网络图构建及核心基因筛选

将枸杞子-骨质疏松的117个交集靶点导入STRING中，得到2 011对相互作用关系(图3)，并将结果以文本形式导出，然后将导出的text文件导入Cytospace软件中，利用cytohubba插件的MCC、MNC、Degree算法选取前20位关键基因，并取并集绘制venn图得到16位核心靶点基因，依次为：白介素-6(IL-6)、JUN、肿瘤坏死因子(TNF)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、AKT1、白细胞介素8(IL-8)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、趋化因子配体2(CCL2)等。见图4。

图3 枸杞子治疗骨质疏松症共同靶点的PPI网络图Fig.3 PPI network diagram of the common target of Lycii Fructus in the treatment of osteoporosis

图4 枸杞子治疗骨质疏松症核心基因Fig.4 Core genes of Lycii Fructus in the treatment of osteoporosis注：A：基于cytohubba插件取MNC、MCC、Degree三种算法Top 20的交集基因；B：枸杞子抗骨质疏松核心基因的互作PPI网络图。

2.4 GO功能富集分析

GO功能富集分析中分子功能结果提示，枸杞子抗骨质疏松症治疗可能与影响核心启动子结合、细胞因子受体结合等有关；细胞组成结果提示，治疗可能与影响膜筏、囊泡腔、质膜、等有关。生物进程结果按照重要显著程度依次为枸杞子治疗骨质疏松症可能与细胞对脂多糖的反应、对氧化应激的反应、对生长因子的反应等有关。结果见图5A～图5C。

图5 枸杞子治疗骨质疏松症核心靶点基因GO功能及KEGG信号通路富集分析气泡图注：A：GO分子功能富集分析气泡图；B：GO细胞成分富集分析气泡图；C：GO生物进程富集分析气泡图；D：KEGG信号通路富集分析气泡图(前20条)。图形左侧字母代表GO名称，下面数字代表富集基因数目占总数目的比例，圆圈大小代表该信号通路所富集基因数目，颜色对应着右侧的颜色标尺，代表-Log10(P)值，颜色越红代表基因富集程度越高，对应的P值越小。Fig.5 The GO function of the core target gene for treatment of osteoporosis and the enrichment analysis of the KEGG signal pathway in Lycii Fructus

2.5 KEGG信号通路富集分析

通过Metascape数据库对核心靶点进行KEGG信号通路富集分析，以P<0.05为显著性差异，同时按重要显著程度选取前20条信号通路(图5 D)，综合有关骨质疏松信号通路的文献，研究发现枸杞子治疗骨质疏松症可能与影响IL-17、TNF、糖尿病并发症中的AGE-RAGE等信号通路密切相关。运用R软件对KEGG信号通路富集分析结果中富集基因数较多、差异较显著的IL-17和TNF通路进行靶标-通路分析，结果见图6。

图6 信号通路机制图Fig.6 Signal pathway mechanism diagram注：A：IL-17信号通路；B：TNF信号通路；图中红色标记代表枸杞子治疗骨质疏松症的潜在作用靶点。

3 讨论

枸杞子所含有的有效化学成分主要有槲皮素、黄豆黄素、β-谷固醇、豆甾醇、谷甾醇α1。槲皮素属于黄酮类化合物，动物试验结果证实槲皮素能够通过调节骨组织中的骨保护素(osteoprotegerin，OPG)和核因子κB受体激活因子配体(receptor activator for NF-κb ligand，RANKL)的表达来抑制破骨细胞的形成，从而减少骨吸收[6]。同时，众多研究[7-9]发现，槲皮素还是柞丝子、乌叶花等多种中医中药的主要化学成分，能够通过RANK/RANKL/OPG、NRF2等信号通路发挥抗骨质疏松症的作用。体外试验[10]结果证实，黄豆黄素能够有效增加去卵巢的骨质疏松模型大鼠股骨骨密度。既往的研究也证实β-谷固醇、豆甾醇、谷甾醇α1均是抗骨质疏松的有效化合物，说明枸杞子治疗骨质疏松疾病是多成分共同发挥作用。

由本研究“有效成分-靶点”网络图和PPI结果表明，枸杞子中多种有效成分作用于不同的靶点基因。Jun属于AP-1转录因子家族成员，参与并调节关键的细胞过程，同时也对骨骼的正常发育和维持很重要[11]。IL-6是重要的炎性因子，国外学者[12]对高加索人群236个家系谱人群调查研究发现，IL-6基因中某一序列的差异及位点的遗传变异可能与骨质疏松存在密切联系。国外一项RCT试验[13]观察抗TNF生物制剂服用一年后类风湿关节炎和强直性脊柱炎患者的骨密度和骨强度显著增加。而这些核心靶点主要与骨代谢或炎性反应相关联，因此也可以推测枸杞子各成分主要是通过调节上述核心靶点来治疗骨质疏松疾病。

研究表明，通过抑制MAPK信号通路能够促进LPS诱导的软骨细胞损伤。同时脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)能够调节JUK、MAPK等信号通路作用于破骨细胞[14]。线粒体是活性氧产生的重要来源，当机体雌激素缺乏会进一步抑制线粒体β氧化，从而增加氧化应激(reactive oxygen species，ROS)的产生[15-16]。上述枸杞子治疗骨质疏松疾病的核心基因调控成骨细胞、破骨细胞涉及细胞增殖、信号转导通路等多种生物学功能，与GO富集结果一致。

KEGG信号通路富集结果显示，枸杞子抗骨质疏松核心靶点基因参与了多条成骨细胞或破骨相关的信号通路，其中IL-17、TNF等信号通路富集的核心基因较多，可能是枸杞子抗骨质疏松疾病的关键信号通路。IL-17A能够通过诱导胶原酶及其抑制物的表达与其他促炎细胞因子发挥协同作用[17]。TNF-α通过MAPK信号抑制成骨细胞分化，提示TNF-α抑制剂可能是炎症性骨丢失的潜在治疗靶点[18]。Kim等[19]发现干燥枸杞的水提取物(lycii radicis cortex，LRC)能够通过减少破骨细胞生成标志物(RANK、TRAP)的合成分泌来抑制RANKL诱导的破骨细胞分化。同样，Park等[20]发现枸杞水提取物干预能够通过诱导OPG/RANKL比例增加抑制成骨细胞激活，发挥抗骨质疏松症的作用。此外，动物试验研究[21]也证实，枸杞能够通过调节OPG/RANKL通路、抑制炎性因子的产生来抑制小鼠颅骨骨溶解。RANKL与破骨细胞标志物RANK的结合能够双向调控NF-κb信号通路作用于破骨细胞的分化[22-24]。由此可见，RANKL/RANK信号通路参与成骨细胞与破骨细胞的分化与NF-κb信号通路和TNF信号通路关系密切，也印证了枸杞子防治骨质疏松疾病的信号通路相互作用、相互联系。

综上所述，本研究通过网络药理学方法对枸杞子治疗骨质疏松症的作用机制进行了深入分析，并在分子层面提供新的研究方向和思路。但由于网络数据库有着一定的局限性，因此具体的分子机制还需进一步的实验去验证。