PM 2.5对去卵巢骨质疏松症大鼠骨密度和生物力学性能的影响

倪清丽 黄惠娟 林妹珠 董怡君刘宗玉 蔡芬 张小蕊

1.中国人民解放军联勤保障部队第九○○医院妇产科, 福建 福州 350025 2.厦门大学附属附属东方医院, 福建 福州 350025 3.福建医科大学福总临床医学院, 福建 福州 350025

绝经后骨质疏松症 (postmenopausal osteoporosis, PMOP)指女性衰老相关性低雌激素效应导致高效骨重塑向骨吸收方向进行致骨脆性增加、骨显微结构改变的一种全身骨代谢性疾病[1]。该病发病率逐年增加[2], 容易导致老年女性群体胸腰椎等部位骨折[3],骨折引发的高致残率和高致死率给社会和家庭带来了巨大的医疗和经济负担[4]。大气细颗粒物PM 2.5 (particulate matter 2.5)是指大气中空气动力学直径≤2.5 μm的固体和液体颗粒物的总称，由于其粒径小，比表面积大，几乎可随呼吸深达肺泡并沉积，进而进入血液循环，引发多脏器损害。国内外流行病学研究[5-7]指出，PM 2.5与较低的骨密度(bone mineral density,BMD)存在关联。本研究拟探讨不同浓度的PM 2.5对去势SD大鼠骨密度及骨生物力学特性的影响，为PM 2.5与绝经后女性骨质健康的关系提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：选取3周龄约50 g的SPF级雌性健康SD大鼠50只，实验动物许可证号 [SCXK(沪)2017-0001]。在中国人民解放军联勤保障部队第九○○医院比较医学科分笼饲养, 自由进食、饮水。饲养环境：温度18 ℃～25 ℃ , 相对湿度为40 %～70 %。将大鼠适应生长一周后随机分为5组，每组10只，分为假手术组、模型对照组、PM 2.5低、中、高剂量组。

1.1.2主要仪器：Thermo Sciencce GUV-15-H-1 大流量采样器；三点力学测量仪器(型号:INSTRON，中国科学院长春科新公司)；双能X线骨密度仪(型号:HOLOGICDISCOVERYW,美国) 。

1.2 方法

1.2.1PM 2.5的收集及混悬液配置

1.2.1.1PM 2.5的采集及处理：自2019年7月-2020年8月，选取福建省环境监测站主楼八楼作为采样点(PM 2.5来源主要为交通排放和生活污染)，采样高度约为10 m，用 Thermo Sciencce GUV-15-H-1大流量采样器采样。PM 2.5采样头 G1200-41(美国 Thermo Sciencce公司)，流量为 1.13 m3/min，用石英纤维膜(英国Whatman 公司)采集大气PM 2.5。为消除可能载带的有机物，采样前需将纤维滤膜至于马沸炉中450 ℃焙烧5 h。收集本地区大气PM 2.5样本，每连续采样24 h更换一次滤膜。将采有PM 2.5的滤膜放入密封袋，于-20 ℃避光保存。

1.2.1.2PM 2.5染毒液制备：将采有PM 2.5的滤膜裁剪成1 cm×1 cm大小，浸入含有超纯水的烧杯中，将烧杯放置于超声振荡器器的水浴箱中，超声4 ℃震荡30 min×6次，8层无菌纱布过滤洗脱PM 2.5颗粒后低温高速离心机离心30 min(12 000 r/min)，弃上清液后沉淀物质真空冷冻干燥12 h。冷冻干燥后水分完全挥发，瓶底的PM 2.5灰色粉末室温称重后加入无菌PBS配制成 2 μg/μL混悬染毒母液，保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2PM 2.5暴露浓度的计算及其依据:低、中、高暴露剂量分别根据中华人民共和国环境空气质量标准(GB3095-2012)一、二级标准 24 小时平均年浓度限值(35、75 μg/m3)，以及国际环保组织绿色和平发布的《2015 年度中国366座城市PM 2.5浓度排名》中PM 2.5年均浓度150 μg/m3进行计算。以 150 μg/m3(0.150 μg/L)为例：健康人通气量以 6 L/min计，24 h的PM 2.5吸入量为 0.150 μg/L×6 L/min×60 min/h×24 h/d=1 296 μg/d；大鼠通气量以73 mL/min(0.073 L/min)计，则24 h 的PM 2.5吸入量为 15.91 μg/d。参照吸入的PM 2.5 在气道深部和肺的沉积率为68 %～70 %。以70 %计算，则实际每日暴露量为15.91 μg×70 %11.14 μg。同法可推算轻、中剂量分别为 2.6、5.57 μg。将3 d剂量一次滴注，低、中、高剂量组每次染毒为7.8 μg、16.5 μg、33.3 μg，即低、中、高剂量组每次染毒分别为3.9 μL、8.25 μL、16.65 μL(PM 2.5混悬母液浓度为2 μg/μL)。假手术组、模型对照组给予生理盐水20 μL，PM 2.5低、中、高剂量组给予PM 2.5混悬液,实验时间持续九个月。

1.2.3建立人工绝经模型：除假手术组外，其余组在气管滴注的5个月后行去势术: 全程严格按照无菌操作进行，去势前禁食禁水8 h。在大鼠腹腔注射3 %戊巴比妥钠溶液(1 mL/kg) ，注射约15～20 min即被麻醉。仰卧位固定、备皮、消毒铺单后背侧双切口入路逐层切开皮肤→皮下筋膜→肌肉和腹膜→腹腔。用一针线将切口两侧肌肉连同腹膜固定，充分暴露操作视野，事先准备好一圈与切口大小相近套线放置于切口处，镊子轻柔拨开脂肪层找到卵巢(呈粉红色桑葚样)，结扎卵巢与子宫结合部，切除卵巢。同法切除另一侧卵巢。术后密切观察大鼠切口情况，切口边缘连续3 d注射青霉素G 20万单位抗菌消毒。假手术组仅取卵巢旁1 cm3大小脂肪组织，余下处理同上。

1.2.4检测指标

1.2.4.1BMD 测定：去势后第2、4个月进行骨密度测定，具体步骤：术前禁食禁水8 h，用3 %戊巴比妥钠溶液对大鼠进行腹腔麻醉，麻醉后铺单,让大鼠呈仰卧位，四肢自然放松状态于骨密度仪检查床上，最大程度伸展大鼠腰椎(L3～5)及右侧股骨，使充分暴露于X线下，运用大鼠测量软件扫描腰椎(L3～5)及右侧股骨，测量骨密度数值。

1.2.4.2骨生物力学测定：使用三点力学生物仪器对分离的左股骨进行三点弯曲测试评估。持续滴注9个月处死大鼠后用高压灭菌后的手术器械取出左侧股骨，剔除周围结缔组织后放入生理盐水当中浸泡2 h，浸泡结束取出后将股骨头凹面向下，股骨头头端朝前的位置放在间距为 20 mm 的两个支撑点上，最大加载速度 2 mm /min，启动开关施加压力，等待股骨断裂后根据力仪器操作屏幕上自带的软件记录载荷-位移曲线并分析数据，最后得出弹性模量、极限载荷、弹性载荷等骨生物力学指标。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 去势大鼠一般情况

各组大鼠术后 3 d 活动较少，进食饮水量减少，考虑与术后切口疼痛有关。各组大鼠于术后第4天均可正常饮食 , 活动恢复正常。各组大鼠术后切口均愈合良好 , 无红肿、皮温高等表现, 无大鼠出现死亡 , 所有实验大鼠于术后1周拆除缝线。

2.2 PM 2.5对去势大鼠不同时间各组间腰椎(L3～5)、右侧股骨BMD的影响

据7个月时测得的骨密度结果显示 , 5组SD大鼠腰椎及右侧股骨BMD比较差异无统计学意义 (P>0.05)。滴注9个月后，模型对照组及PM 2.5各剂量组腰椎及右侧股骨 BMD 与本组去势7个月时比较差异有统计学意义 (P<0.05)。滴注9个月后PM 2.5去势组腰椎及右侧股骨BMD低于假手术组及模型对照组,差异有统计学意义(P<0.05)，且PM 2.5各组间呈现一定的剂量关联趋势，中、高剂量组BMD降低趋势明显，同时模型对照组腰椎及右侧股骨BMD明显低于假手术组，差异有统计学意义 (P<0.01)，见表1。

表1 大鼠去势后不同时间腰椎(L3～5)、右侧股骨BMD 比较Table 1 Comparison of BMD of lumbar vertebrae (L3-5) and right femur at different time after ovariectomy in g/cm2)

2.3 PM2.5对去势大鼠各组间左侧股骨生物力学比较

三点弯曲实验结果显示：模型对照组、PM 2.5低剂量组股骨的弹性载荷、极限载荷、弹性模量与假手术组相比均下降，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较，PM 2.5剂量组的股骨弹性载荷、极限载荷和弹性模量降低(P<0. 05) ，下降趋势与BMD一致，高剂量组下降最为显著。见表2。

表2 PM 2.5对去势9个月后大鼠左侧各组间股骨生物力学比较

3 讨论

PMOP 是临床上常见的原发性骨质疏松症的一种类型[8],是老年女性群体发生胸腰椎及腕部骨折的主要原因[2]。国内外流行病学调查[5-7]表明环境中的大气细颗粒物(PM 2.5)暴露与骨密度(BMD)降低及 OP 的发病有关。因此，明确PM 2.5暴露对OP的影响，对引起人们对环境问题和绝经后女性骨骼健康的重视具有重要意义。

双侧卵巢切除大鼠模型已被广泛应用于妇女绝经后骨质疏松症的动物模型[9-10]，研究[11]发现大鼠去卵巢后, 在12周内即可发生骨质疏松。因此，课题组选择对饲养5个月后的SD大鼠进行去势手术，之后继续对去卵巢SD大鼠进行PM 2.5气管滴注3～4个月，以观察PM 2.5是否会加重SD大鼠绝经后骨量减少。本实验测定结果显示，模型对照组与假手术组相比，腰椎、股骨的骨密度及骨生物力学均有显著下降，证实OVX骨质疏松模型成功。

BMD 降低是骨质疏松时骨变化的重要特征,在目前众多检测BMD的方法中，DXA被公认为是诊断骨质疏松的金标准[12-13]。本实验采用DXA对大鼠腰椎和股骨进行了检测，测量结果表明，气道滴注第9个月末时, 模型对照组及PM 2.5剂量组大鼠腰椎及右股骨 BMD 与本组7个月末时比较差异有统计学意义 (P<0.05)，这与大鼠的骨骼发育成熟期及皮质骨代谢周期一致。实验进一步发现PM 2.5染毒可明显降低去卵巢大鼠的骨密度,中、高剂量组的BMD明显降低，而且骨损伤与PM 2.5剂量之间呈负相关，即随着染毒剂量的增加，单位骨组织的骨矿含量下降，骨强度降低。由此可见，控制大气污染，可能成为预防骨质疏松症及其相关骨折的一项新措施。

生物力学特性综合反映了骨结构连续性、骨量、骨皮质厚度以及骨的材料特性，从生物力学角度来看，骨脆性不仅仅由骨强度来定义，而是由生物力学中的弹性模量、脆性等众多指标构成[14-15]。因此本实验选择弹性载荷、极限载荷、弹性模量具有代表性的三大指标来研究PM 2.5对去势大鼠骨组织生物力学性能的影响。结果表明模型对照组、PM 2.5低剂量组的弹性载荷、极限载荷、弹性模量均低于假手术组，差异有统计学意义(P<0. 05)。与模型对照组比较，PM 2.5剂量组降低了股骨的弹性载荷、极限载荷和弹性模量(P<0. 05)，这说明PM 2.5加重了骨生物力学和结构力学性能的下降，减少骨组织的承载能力，降低骨骼抵抗外力冲击的能力，从而加速去卵巢后引起的骨质疏松，增加骨折的发生。

PM 2.5 作为大气污染中的主要污染物，由于粒径小，比表面积大，易富集多环芳烃等特点，可随着人的呼吸进入体内导致呼吸和心血管等系统疾病，其在骨代谢中的作用机制尚不完全清楚。长期暴露于PM 2.5 引起的氧化性损害和炎性反应，可能影响骨骼健康[16]。张宝玉等[17]的实验结果表明PM 2.5可能是通过调节RANKL/OPG 信号通路的表达，诱导产生更多破骨细胞，影响骨代谢，最终引起骨量减少甚至导致骨质疏松症。PM 2.5中的PAHs、重金属、多氯化联苯同源物等成分可诱发癌变，肿瘤细胞可以通过刺激破骨细胞增殖，加速骨丢失，从而引起骨质疏松症[18]。因此后续实验将通过氧化损伤、OPG/RANKL/RANK信号通路、癌变作用等方面研究PM 2.5暴露如何加速PMOP的发展。

综上，PM 2.5会加剧去势大鼠BMD及生物力学指标的下降，但确切的作用机制及信号通路尚无定论，值得进一步研究探讨。