探讨彝药恒古骨伤愈合剂治疗骨质疏松症的系统药理学作用机制

贺美宇 李兆勇 张晨阳 苏友贤 杨少锋*

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208 2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410208

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种以骨量减少、显微结构损坏，致使脆性骨折风险增加为特征的全身性骨骼疾病[1]，其主要的临床症状有疼痛、脊柱变形、骨折等[2]。2010年-2016年中国OP患病率流行病学Meta分析[3]提示，60岁以上人群OP总体患病率约为36%。随着中国人口老龄化的不断加剧，对于OP的治疗使得医疗和社会经济效应进一步增加[4]。恒古骨伤愈合剂(osteoking,OK)是运用于骨折、骨质疏松、骨折术后、骨关节病、腰椎间盘突出症等方面的彝族药方，多项临床、基础实验证实其在改善骨密度、骨生物力学、促进OP相关压缩性骨折愈合等方面具有显著疗效[5-7]，为临床治疗OP提供新的选择。但OK治疗OP的具体作用机制尚未完全阐明。本研究拟借助系统药理学方法，探寻OK的药物靶点，分析OK治疗OP药效成分的分子作用机制，为后期基础研究提供思路。

1 材料和方法

1.1 获取OK活性成分与基因靶点

应用TCMSP[8]( https://tcmspw.com/tcmsp.php)分析工具，分别以“黄芪、人参、红花、三七、杜仲、陈皮、钻地风”为检索词，检索到的活性成分按照OB≥30%、DL≥0.18进行筛选；通过化学数据库[9](http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp)的中药与化学成分数据库检索“鳖甲”活性成分；通过中国知网、万方检索关键词为“钻地风”与“成分”的相关的文献，筛选出文献中阐述的活性成分。将检索到的活性成分通过Swiss Target Prediction[10](http://new.swisstargetprediction.ch/)数据库分析相关基因靶点。

1.2 筛选OP致病靶点

通过GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(http：/www.omim.org/)、DisGeNET(http：//www.disgenet.org/)、TTD[11](http://db.idrblab.net/ttd/)等数据库检索OP相关的基因靶点，删除重复检索的数据。

1.3 PPI网络构建与KEGG和GO分析

借助STRING(http：//STR-ING-db.org)和 Cytoscape 3.7.1软件构建交集基因靶点蛋白互作网络(PPI)。交互分数最低要求>0.4被认为具有统计学意义，本研究设定交互分数为0.9。将交集基因靶点输入DAVID和KEGG Mapping数据库，设定阈值P<0.05。运用R软件对OK-OP核心靶基因进行GO富集分析柱状图。

1.4 “药物-活性成分-疾病-靶点”模型构建

利用Cytoscape软件构建“药物-活性成分-疾病-靶点”可视化模型；通过Network Analyzsis拓扑分析网路各节点的degree值，degree值越高，提示发挥主要作用概率越大。

1.5 分子对接模拟

从PDB数据库(http：//www.rcsb.org/)中下载靶点蛋白，借助PyMol去除水分子并摘取出自身配体。通过PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载活性成分3 D结构文件。将靶点蛋白导入 Autodock Tools 1.5.6 软件中加氢、计算总电荷、设置原子类型，保存为*pdbqt格式文件；利用Autodock Tools软件将配体分子设置可旋转键后保存为*pdbqt格式文件。运行Vina对接，Grid box为原配体中心的周围所有氨基酸残基，选择刚性对接，按照每个配体与受体对接的最优结合能进行排序，选取结合能最小的对接构象导出*pdbqt格式文件。最后运用PyMol 软件将对接构象绘制可视化模型。

2 结果

2.1 筛选OK活性成分和靶蛋白信息

通过TCMSP、化学数据库以及参考左国营[12]、曾光[13]有关“钻地风”活性成分的研究文献，共筛选出180个活性成分，节选degree值前20的活性成分信息(表1)。选取度值排名前10个活性成分用于分子对接验证。

表1 OK的活性成分信息(degree值前20)Table 1 Active ingredient information of OK (degree top of 20 )

2.2 OP致病靶点

通过GeneCards、OMIM、DisGeNET、TTD分别检索出致病基因靶点数为4 273、10、1 098、34；去除重复的基因，并导入Uniprot(http://www.Uniprot.org/)数据库，限定物种为“Human”，剔除非人源靶点，最后得到4 661个OP致病基因靶点。

2.3 交集靶点获取与Venny图

借助Venny(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，获取到OK与OP的277个交集基因靶点(图1)，将交集靶基因导入Uniprot数据库统一ID。

图1 恒古骨伤愈合剂-骨质疏松症 Venny图Fig.1 OK-OP Venny diagram

2.4 PPI 网络构建

借助STRING 与Cytoscape构建PPI网络(图2)；网络中共有节点277个，线条数5 704条，平均节点degree值41.2；其中发现丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、白蛋白(ALB)、白介素6(IL-6)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)等是整个网络的核心蛋白，说明其在PPI互作网络中占具重要地位，可作为OK治疗OP的潜在靶点。

图2 PPI网络中的核心蛋白Fig.2 The core proteins in the PPI network

2.5 GO 和 KEGG分析

GO功能富集分析结果提示：确定了2 655条生物学过程，主要牵涉有细胞对脂质、有毒物质、脂多糖、细菌源分子、无机物、有机环化合物、有机氮化合物的反应等(图3)。KEGG信号通路分析确定了272条结果，排除广泛的信号通路，主要涉及：PI3K/Akt(40)、MAPK(31)、RAS(23)等信号通路(图4)，提示OK可能通过以上多通路作用于OP。

图3 生物学过程富集分析柱状图Fig.3 Histogram of biological process enrichment analysis

图4 KEGG通路富集分析前20条结果Fig.4 The top of 20 result of pathway

2.6 构建“药物-活性成分-靶点”网络模型

通过Cytoscape软件构建OK干预OP的活性“药物-活性成分-靶点”网络图(图5)。其中菱形为组分药物，八边形为药物活性成分，圆形为共有活性成分，六边形为交集基因靶点。

图5 药物-活性成分-疾病-靶点互作网络Fig.5 Drug-active component-disease-target interaction network

2.7 分子对接模拟分析

选取受体蛋白及自身配体信息(表2)以及对接后配体与受体结合能(表3)。最低结合能小于-5.0 kJ·mol-1即表明活性分子与受体蛋白结合效果良好，结合能越低，表明结合能力越强。由表3结果提示熊果酸与四个受体蛋白结合能均小于-5.0 kJ·mol-1，并且与AKT1、ALB、IL-6结合能是活性成分中最低的，提示熊果酸可能在发挥药效作用中起到重要作用。将对接结果利用PyMol软件绘制模型图(图6)，由图可知，熊果酸与AKT1在ARG-346处形成氢键，与ALB在LYS-195、ASN-295处形成氢键，与IL-6在ASN-61、LEU-62、GLU-172处形成氢键。

图6 靶点蛋白和活性分子相互作用模型Fig.6 Interaction model between target protein and active molecule

表2 参与分子对接的受体蛋白信息

表3 OK中核心活性成分的分子对接(kJ·mol-1)

3 讨论

目前多数学者认为OP的发生在中医理论中与肾、肝、脾、血瘀等有关，其中以肝肾亏虚为主。肾为先天之本，主藏精，精生髓，髓养骨，故骨为肾所主；肝藏血，在体为筋，血养筋，筋司运动。故肝肾亏虚，劳耗精血，筋骨失养，乃生懈堕[14]。临床OP患者多见全身疼痛，或某定处刺痛难忍，活动受限，中医学认为机体内气血瘀滞，“不通则痛”；卧床日久，气血不足，筋骨懈堕，脾气亏虚，痰湿内生，故可见四肢萎废，纳食欠佳，肺生痰浊等症。OK是具有自主知识产权的民族药物，组方包括黄芪、人参、红花、三七、杜仲、鳖甲、陈皮、钻地风、洋金花。黄芪、人参补气行气；红花、三七活血祛瘀，使瘀血去而新血生；杜仲补肝肾、壮筋骨；鳖甲滋阴填隨；陈皮行气健脾，燥湿化痰；钻地风舒筋活络；洋金花又称曼陀罗花，其提取物可用于麻醉制剂，可祛风除湿，解痉止痛。诸药合用，共行补肝肾、益精血、健脾益气、活血祛瘀、舒筋止痛之效。多项实验[15-17]证明OK可有效促进去势动物骨髓基质干细胞分化、成骨细胞增殖、成骨物质形成、提高骨密度等，可能通过调节TGF-β/BMP-7、TGFβ/Smad、PI3K/AKT/GSK-3β等信号通路起到改善OP的作用。系统药理学是分析药物在药物作用网络与生物网络相互作用关系，从而理解药物和机体相互作用的科学[18]。借助目前理论与方法较为成熟的系统药理学探索OK治疗OP的作用机制，可为后期体内外实验设计与验证提供思路与方向。

本研究在收集活性成分过程中，“鳖甲”与“钻地风”在TCMSP中无数据，但这两种药物是OK的特色药物，本课题组综合考虑决定在目前已有的国内外文献资料中筛选出“鳖甲”与“钻地风”的活性成分，并通过相关化学成分数据库排除不稳定的、难以被人体吸收的或会被胃肠道分解的成分。活性成分中degree值较高的有槲皮素、山奈酚 、反式十八烷酸、反11-二十碳烯酸、熊果酸、β-谷甾醇、委陵菜酸等。Zheng等[19]通过网络药理学预测出熊果酸具有改善OP的潜力，随后经动物实验验证熊果酸对去卵巢大鼠OP有明显的保护作用，体外细胞实验证实熊果酸可阻断自噬途径在破骨细胞分化过程中被激活。槲皮素干预的低钙高镁饮食大鼠血清中血钙量、血磷量、BALP水平明显升高，血镁量、BGP、CTX1、t PINP显著降低，可能与槲皮素具有增加成骨细胞分化活性和可抑制破骨细胞骨吸收的功效相关[20]。山奈酚可通过降低miR-10a-3p，促进转录因子RUNX2、趋化因子CXCL12、成骨细胞分化和骨形成有关的转录因子Osterix的表达，促进BMSC成骨分化，从而提高去卵巢大鼠的骨密度[21]。反式十八烷酸、反11-二十碳烯酸、β-谷甾醇、委陵菜酸未检索到与OP相关研究文献，其是否单独或联合对OP有作用，可为下一步药理实验提供选择。PPI网络中各靶点之间存在相互关联、相互影响的复杂关系，研究提示OK可能主要作用于AKT1、ALB、IL-6、MAPK3等靶点蛋白，提示OK可能通过影响各靶点产生协同或抑制等综合作用影响骨细胞功能，促进成骨的发生，从而改善OP相关病理变化。Mukherjee等[22]通过培养AKT1基因敲除的骨髓基质细胞或间充质干细胞发现破骨细胞的形成明显受到抑制，提示AKT1是成骨细胞中一种独特的信号中间产物，可以控制破骨细胞的分化。一项针对1 654例2型糖尿病患者ALB、HB与OP相关性的研究[23]表明，男性、女性ALB水平与OP危险比值比相关。IL-6可激活MAPK、PI3K/AKT等多条通路，激活破骨细胞，促进骨髓内基质细胞转化为成熟骨细胞，是OP的重要预测因子之一[24]。

KEGG分析提示OK涉及PI3K/Akt、MAPK、RAS等多条信号通路作用于OP，不同的通路之间可存在相互协同作用。磷酸肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B (PI3K/AKT)为调节细胞转录、翻译、增殖、分化、存活、迁移和代谢等基本功能的最重要的信号通路之一[25]。Xi J等[26]运用特异性PI3K抑制剂LY294002阻断PI3K/AKT转导通路，发现成骨细胞增殖、钙积累、OCN成体、ALP活性和Runx2 mRNA的表达等被显著抑制。张波等[27]通过药物干预BMP、IL-1、1, 25 (OH)2D3、PTH、OPG、RANKL和雌激素等因子而作用于MAPK信号通路，可提高骨质疏松症的治疗效果。肖浩[28]指出骨组织局部RAS系统过度激活时，可以抑制成骨细胞分化，促进破骨细胞成熟和分化，或通过氧化应激反应损伤成骨功能，结果可导致骨的吸收增加、形成减少，参与OP发生。

综上，本研究借助系统药理学方法初步明确了OK部分有效成分以及其通过多靶点、多通路参与促进成骨、抑制破骨等作用，为临床OK治疗OP与预防OP相关压缩性骨折提供了理论依据。