齐墩果酸局部给药对去卵巢小鼠骨折愈合的影响

程韶 杨骏杰 王晶 赵永见1,2, 唐德志1,2, 张岩1,2, 赵东峰1,2, 孙悦礼1,2, 赵世天1,2, 陶渝仁1,2, 施杞1,2, 舒冰1,2,* 王拥军2,*

1. 上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032 2. 上海中医药大学，上海市中医药研究院脊柱病研究所，上海 200032 3. 教育部重点实验室(筋骨理论与治法)，上海 200032

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量低下和骨微结构破坏为特征的全身性代谢性骨病[1]，骨质疏松性骨折(osteoporotic fractures，OPF)是OP患者最为严重的并发症[2]，由于患者具有骨质疏松的病理基础，导致骨折后愈合时间延长、愈合质量变差、骨形成能力降低[3-4]。预计2050年全球骨质疏松性髋部骨折将有一半发生在亚洲，而中国将有599万例OPF发生，医疗卫生支出将超过25.4亿美金，给我国医疗卫生事业带来巨大的经济负担[5]。OPF患者多为中老年人，常合并其他器官或系统疾病，全身状况差，易发生并发症，导致更高的致残率和死亡率[1]。因此，寻求能够促进骨质疏松性骨折愈合、缩短疗程、减少并发症的有效药物具有重要的临床意义。

根据中医“肾主骨”理论，补肾中药是中医临床治疗OPF的常用药物，取得了良好的临床疗效[6-7]。齐墩果酸(oleanic acid，OA)是补肾中药女贞子、墨旱莲等的主要有效组分之一[8-9]，前期研究[10]发现OA可以呈剂量依赖性的抑制Notch信号通路活性，促进间充质干细胞的早期成骨分化，异位成骨实验也证明了OA可显著增加异位骨内骨基质的比例，促进成骨。为了进一步验证OA是否具有促进OPF愈合的潜在能力，也为了进行给药方式的优化，避免长期口服服药的多种局限性，使OA在骨折局部能够集中持续地释放，本研究采用微型渗透泵局部缓释OA的方式，对去卵巢骨折小鼠进行干预，从而观察OA局部缓释对OPF愈合的作用，以期为中药治疗OPF提供新的应用途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验材料与仪器：Alzet植入式渗透泵(#1002、#1004，美国Alzet公司，可持续释放药物时间分别为14 d和28 d)；齐墩果酸(#O5504，美国Sigma公司)；雌二醇ELISA检测试剂盒(#ab108667，abcam上海公司)；RNA提取试剂盒(#74104，德国QIAGEN公司)；反转录试剂盒(#RR0371A，日本Takara公司)、QPCR试剂盒(#RR820A，日本Takara公司)；阿尔辛蓝染液(#A5268-25 G，Sigma上海公司);橙黄G(#O3756-25 G，Sigma上海公司);Micro-CT扫描分析系统(μCT80，瑞士Scanco Medical公司)；TreadScan被动步态分析仪(GaitScan，美国CleverSys Inc公司)。

1.1.2实验动物：采用3月龄雌性C57BL/6小鼠，45只，每只体重20 g左右，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，饲养于上海中医药大学实验动物中心(伦理编号：PZSHUTCM18121414)。采用随机数字表法，将实验动物随机分为假手术组、模型组和OA组，每组各15只。

1.2 方法

1.2.1模型制备：模型组和OA组小鼠行双侧卵巢切除术(OVX)，假手术组仅切除卵巢周围脂肪组织。术后3个月建立左侧胫骨中段骨折模型，小鼠以4 %浓度的异氟烷诱导吸入麻醉，待小鼠进入深度麻醉后，将异氟烷浓度改为2 %维持麻醉。将小鼠侧卧位置于操作台，左后肢备皮，并沿小鼠左侧胫骨外侧前缘作一约1 cm的纵行切口，分离胫骨周围筋膜、肌肉，暴露胫骨中段。将1 mL一次性注射器针头从胫骨平台前外侧沿胫骨长轴刺入胫骨约1.5 cm，把注射器针头稍退回后剪断针头，用迷你电锯锯断胫骨中段，将注射器针头完全插入胫骨内进行髓内固定，并沿胫骨插入输药管释出端，使输药管出口抵达骨折断端部位。另在小鼠左侧肋骨下缘切开表皮，制备长约0.6 cm左右的横行切口，用血管钳由切口处皮下沿肋骨向脊柱方向钝性分离皮下筋膜，撑出1.5 cm×0.8 cm左右胶囊大小的空间。OA组将含有OA工作液的植入式渗透泵植入制备的皮下空间，裁剪输药管输入端并与释药棒连接，缝合切口，隔日观察小鼠饮食和活动情况。通过检测骨折后小鼠腰椎骨密度和血清雌二醇水平判断OVX造模是否成功[11]。

1.2.2药物干预：根据前期研究[10]，20 μmmol/L的OA溶液具有较好的促进骨形成作用，且无细胞毒性，因此取OA粉末9.13 μg溶于1 mL的0.5 %羧甲基纤维素钠溶液中，配置成浓度为20 μmmol/L的OA工作液，在OA组小鼠的每个渗透泵中注入100 μLOA工作液。假手术组、模型组小鼠的渗透泵内仅注入100 μL的0.5 %羧甲基纤维素钠溶液。

1.2.3取材、样本处理：以术后14、28 d作为实验终点，采用二氧化碳吸入麻醉联合颈椎脱臼法处死小鼠。常规眼球取血，分离并收集血清。剪开左侧胫前皮肤，分离肌肉和筋膜，剪断肌腱分离胫骨，根据实验需要将左侧胫骨组织、肝脏组织、肾脏组织置入50 mL离心管，10 %中性缓冲甲醛固定液中固定24 h后流水冲洗，之后放于75 %酒精中保存，以备Micro-CT扫描。或将取材的左侧胫骨组织置入1.5 mL EP管液氮中冻存，于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.4观察指标

1.2.4.1血清雌二醇检测：设置标准孔和待测样品孔，分别加入标准品和待测血清25 μL后再加入200 μL Estradiol-HRP，37 ℃孵育2 h。孵育完成后，吸净孔内液体，并用300 μL洗涤液，洗涤三次，每孔加入100 μL TMB底物液，室温中避光孵育30 min，每孔加入100 μL终止液，混匀后，用酶标仪检测450 nm的吸光度测得数值。

1.2.4.2小鼠步态功能分析：将小鼠放入被动步态分析仪管道，打开跑道开关以10 cm/s的速度运行跑步机，当小鼠在跑道内稳定跑步时，按记录键开始记录，使小鼠被动跑步20 s，采集整个时期后自动停止。使用步态扫描仪软件“TreadScanTM2.0”分析小鼠左后肢(骨折侧)与右后肢(健侧)的平均步态长度和平均迈步时间。

1.2.4.3小鼠胫骨组织、腰椎的Micro-CT扫描进行骨密度测定：取出在75 %酒精中保存的胫骨组织标本放入Micro-CT(μCT80，瑞士Scanco Medical公司)仪检测舱，以55 kV电压、72 μA电流、300 ms/帧速率、10 μm横断面厚度断层成像扫描左侧胫骨(胫骨平台至踝关节之间的部位)和整个第五腰椎标本，对所得图像进行三维重建，采用Micro-CT评估程序V6.6分析3 D腰椎的骨密度( bone mineral density, BMD)参数。

1.2.4.4小鼠胫骨组织形态学观察：胫骨组织完成Micro-CT检测后，放入14 %EDTA溶液中，在摇床上脱钙21 d，每3天更换EDTA脱钙液。标本完成脱钙后经常规脱水、石蜡包埋、切片进行Alcian Blue/Orange G染色，观察骨痂组织病理学改变。

1.2.4.5骨痂组织成骨相关基因及Notch信号通路靶基因的表达：取出-80 ℃冰箱中的胫骨组织，截取胫骨骨痂组织，研磨后加入Trizol裂解，加入氯仿分层后，加入异丙醇吹打混匀，离心后取沉淀，用75 %酒精洗涤，自然晾干沉淀后以DEPC水溶解沉淀，测定RNA溶液浓度。将RNA逆转录为cDNA，采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)实验检测靶基因的表达水平。各基因特异性引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequence of PCR primer

1.3 统计学分析

使用SPASS 22.0软件进行统计分析，各组计量资料以均数±标准差表示。对满足正态性、方差性检验的多组间数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验；两组间比较采用独立样本t检验，检验水准α=0.05，P<0.05，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠骨折后腰椎BMD与血清雌二醇的比较

与假手术组相比，术后14 d模型组和OA组的腰椎BMD降低(P<0.05)，与假手术组相比，术后28 d模型组血清雌二醇含量下降(P<0.05)，与模型组相比，OA组血清雌二醇含量升高(P<0.05)，表明OVX导致的小鼠骨质疏松模型成立，OA组局部给药能够提高OVX后小鼠血清雌二醇含量(表2、图1)。

表2 各组小鼠骨折后腰椎BMD、血清雌二醇的比较

图1 各组小鼠骨折后腰椎BMD、血清雌二醇的比较Fig.1 Lumbar BMD and serum estradiol were compared in each group after fracture注：与假手术组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。

2.2 各组小鼠左侧胫骨组织三维重建情况

骨折后14 d，左侧胫骨三维重建结果如图2所示，假手术组骨折线模糊，骨折端有大量骨痂形成，模型组仍有部分骨折线，OA组骨折线模糊；28 d时，假手术组骨折已基本愈合，骨痂较少，模型组骨折部位仍有较大的骨痂，OA组骨折部位骨痂较少。

图2 各组小鼠骨折后左侧胫骨三维重建Fig.2 3D reconstruction of the left tibia of mice in each group after fracture

2.3 各组小鼠骨折后胫骨Alcian blue/Orange G染色结果

各组小鼠骨折术后14、28 d胫骨组织Alcian blue/Orange G染色结果如图3所示。假手术组骨折端可见大量骨痂和新生软骨细胞形成，模型组14 d有少量骨痂且骨痂稀疏，骨痂组织中多见脂肪细胞。OA组可见含有软骨组织的骨痂，且已有大量骨小梁形成。28 d时，假手术组骨折已基本愈合，与假手术组相比模型组仍有较大骨痂，骨折尚未愈合，OA组骨痂体积较小，骨折已接近完成骨痂塑形过程。

图3 各组小鼠骨折后Alcian blue/Orange G染色结果(×100)Fig.3 Alcian blue/Orange G staining of tibia in each group mice after fracture(×100)

2.4 各组小鼠骨痂组织中Notch信号通路靶基因Hes1和成骨相关基因的表达情况

由于前期研究中，OA具有抑制Notch信号通路，促进骨形成的作用，因此本研究进一步检测了各组小鼠骨痂组织中Notch信号通路下游靶基因和成骨相关基因的表达水平。

如图4所示，术后14 d时，与假手术组相比，模型组小鼠骨痂组织中Notch信号通路靶基因Hes1 mRNA表达水平升高(P<0.05)；OA组Hes1 mRNA表达水平低于模型组(P<0.05)。28 d时各组小鼠骨痂组织中Hes1 mRNA表达水平比较差异没有统计学意义。

图4 各组小鼠骨痂组织中Notch信号通路靶基因Hes1表达情况Fig.4 Notch signaling pathway target gene Hes1 in bone callus tissue of mice in each group注：与假手术组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。

如图5所示，骨折术后14 d，与假手术组相比，模型组骨痂组织中成骨相关基因Runx 2、OCN、ALP的mRNA表达水平降低(P<0.05)。OA组骨痂组织中Runx 2、OCN的mRNA表达水平均高于模型组(P<0.05)。相较于模型组，OA组骨痂组织中ALP的mRNA表达水平有升高趋势，比较差异没有统计学意义。骨折后28 d，与假手术组相比，模型组骨痂组织中Runx 2、ALP和OCN的mRNA表达水平降低(P<0.05)。OA组骨痂组织OCN的mRNA表达水平高于模型组(P<0.05)，但Runx 2、ALP mRNA表达水平与模型组比较差异没有统计学意义。

图5 各组小鼠骨痂组织中成骨相关基因的表达情况Fig.5 Expression of osteogenic related genes in callus tissue of mice in each group注：与假手术组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。

2.5 各组小鼠骨折后步态分析

根据上述结果，OA局部缓释对骨折后14 d时Notch信号通路及成骨相关基因的作用较为显著，对骨折后14 d时骨痂的愈合过程具有较显著的促进作用。因此，本研究进一步检测了14 d时模型组与OA组小鼠进行了后肢步态分析。如图6所示，骨折术后14 d时，模型组与OA组小鼠左后肢(骨折侧)与右后肢(健侧)平均步态长度比较差异均没有统计学意义。模型组小鼠左后肢平均迈步时间显著高于右后肢(P<0.05)，OA组小鼠左后肢平均迈步时间低于模型组小鼠(P<0.05)，且与右后肢比较差异没有统计学意义。见表3。

图6 各组小鼠骨折后步态分析Fig.6 Analysis of gait of mice in each group after fracture注：与模型组右后肢相比，*P<0.05；与模型组左后肢相比，#P<0.05。

表3 各组小鼠骨折后平均迈步时间

2.6 渗透泵药物释放时间及OA的肝肾毒性补充结果

如图7所示，将吲哚青绿注入渗透泵，并将渗透泵移植至骨折小鼠，近红外观察吲哚青绿通过输药管向骨折局部渗透的时间。结果表明：渗透泵植入72 h后，泵中的液体可到达骨折局部。

图7 近红外观察吲哚青绿在渗透泵中释放的时间Fig.7 The release time of indolecyan green in pump was observed by NIR

假手术组和OA组小鼠骨折后28 d时肝脏和肾脏组织HE染色结果表明OA局部给药无明显肝肾毒性，见图8。

图8 各组小鼠骨折后肝脏、肾脏HE染色(×100)Fig.8 HE staining of liver and kidney of mice in each group after fracture(×100)

3 讨论

齐墩果酸是中药女贞子、墨旱莲的主要有效组分之一，其在抗骨质疏松、骨保护方面的作用已被证实[12]。课题组前期体内外实验研究表明[13]，OA能够呈剂量依赖性抑制RANKL介导的破骨形成和功能，抑制OVX导致的小鼠骨丢失。此外，有研究[14-15]表明OA口服能够促进骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)的成骨分化，提高OVX小鼠的骨密度，改善骨微结构，减少骨丢失。然而目前，中药治疗OPF大多以口服给药方式为主，其中胃肠道反应是较常见的不良反应，并且还存在长期使用依从性差的问题。其次，口服后药物进入全身大多数组织器官，不能集中作用于骨修复局部。因此，针对这一问题，本研究采用了Alzet公司的植入式渗透泵作为给药载体，这是一种可植入实验动物皮下或腹腔内的渗透压泵，通过导管以恒定的速度持续准确地输注测试药剂，该设备在动物细胞给药、动物模型建构、药物及分子筛选、药理药代药效等众多领域有着广泛应用[16-17]。通过吲哚青绿近红外显影方式，笔者观察到渗透泵植入72 h后，渗透泵内的液体可以到达骨折局部(图7)。因此，本研究采用此给药方式，探讨局部缓释OA对卵巢切除小鼠骨折愈合的作用。

总体来说，OA局部缓释能够促进OPF愈合，且相较于28 d，OA干预14 d后的作用更显著，这可能是因为小鼠骨折术后28 d骨痂已接近塑形晚期，此时破骨细胞的塑形作用更为显著，且这也与前期体外研究的发现，即OA促进早期骨形成的结论相吻合[10]。从预后功能角度，步态分析显示，干预14 d后，OA组小鼠左后肢(骨折侧)的平均迈步时间显著低于模型组，说明相同距离内OA组小鼠骨折肢体的接触地面的次数显著增加，可以推断局部给予OA干预14 d时，已经可以改善骨折后肢体的功能活动受限或疼痛感，从而改善去卵巢小鼠骨折肢体的功能恢复。此外，本研究进一步检测了OA局部缓释干预28 d后，小鼠肝脏和肾脏组织的组织学变化，未见明显异常(图8)。

Notch信号通路是一种在物种进化过程中高度保守的信号通路[18-19]，研究发现阻断BMSCs中的Notch信号，会导致小鼠骨折延迟愈合或骨不连，但在成骨细胞或软骨细胞中阻断Notch信号，则不会出现骨不连，这提示Notch信号通路的激活对于骨折早期BMSCs具有重要作用，而对于骨折中晚期BMSCs成骨、成软骨分化后没有显著作用[20]。进一步研究发现，在间充质干细胞或者软骨-骨前体细胞中激活Notch信号通路，可以促进细胞增殖，维持其干细胞特性，抑制细胞分化[21-22]；而在间充质干细胞中抑制Notch信号通路，则可以促进干细胞的分化，进入成骨或成软骨状态[23-24]，由于BMSCs在骨折愈合中扮演者重要的角色，其介导的骨形成亦是骨折愈合过程中的重要病理环节[25-26]。因此，结合骨折愈合的病理过程规律和Notch信号通路的作用特点，在骨折早期阶段，需激活BMSCs中的Notch信号通路，从而促进BMSCs的增殖；而在骨折急性期后，需要抑制BMSCs中的Notch信号通路，从而促进BMSCs的分化和骨形成。

Hes1是Notch信号通路的重要靶基因之一[27]。本研究显示，与模型组相比，OA局部缓释14 d后，可以显著降低骨痂组织中Hes1 mRNA的表达，提高骨形成相关基因的表达水平。前期体外研究已经证明，OA可以通过抑制Notch信号通路促进BMSCs的成骨分化，本研究从体内实验的角度验证了OA能够抑制去卵巢小鼠骨折14 d时Notch信号通路下游靶基因Hes1的表达，促进骨形成相关基因的表达。而在骨折28 d时，假手术与模型组骨痂组织中Hes1 mRNA的表达水平未见显著差异，这再次验证了Notch信号通路的激活对于骨折早期BMSCs具有重要作用，对BMSCs成骨、成软骨分化后作用并不显著。而OA局部干预28 d时，其对Notch信号通路作用不显著，同时对成骨相关基因表达水平的增强作用亦有所减弱。因此，OA局部缓释可能通过抑制骨折愈合早中期局部BMSCs中的Notch信号通路，促进BMSCs的成骨分化，加速去卵巢小鼠的骨折愈合。而当BMSCs分化为成熟的成骨或成软骨细胞，骨折愈合接近末期，由于Notch信号通路活性较低，OA对Notch信号通路也无显著抑制作用。

综上所述，OA局部缓释能够促进去卵巢小鼠的骨折愈合，这可能与其抑制骨折愈合早中期BMSCs中Notch信号通路、上调成骨相关基因表达的作用有关，同时该研究也为中药治疗OPF提供了新的应用途径和理论依据。此外，OA还具有抗氧化、抗炎调节免疫等多种作用[9]，活性氧、炎症等均是影响骨代谢的重要因素[28-29]，因此OA局部缓释促进小鼠骨质疏松性骨折的愈合，是否与其抗氧化、调节免疫等作用有关，仍需今后进一步研究探索。