CREB1基因与抑郁症和双相Ⅱ型障碍的关联研究

施 波，陈建民，赵俊雄，唐 伟，范卫星，张程赪，张 晨

1.浙江省金华市第二医院精神科，金华 321016；2.温州医科大学附属康宁医院精神科，温州 325000；3.广东省韶关市粤北第三人民医院精神科，韶关 512200；4.上海交通大学医学院附属精神卫生中心心境障碍科，上海 200030

抑郁发作是一种常见的心境障碍性疾病，以显著的情绪低落、兴趣减退、认知功能受损为主要特征，严重者可出现消极观念和行为［1］。抑郁症和双相Ⅱ型障碍是常见的抑郁发作类型；抑郁症指曾出现多次抑郁发作而无躁狂发作，双相Ⅱ型障碍指包含一次或以上重性抑郁发作以及至少一次轻躁狂发作的双相障碍（不能有躁狂发作或混合发作）［2］。在实际临床工作中，抑郁症、双相Ⅱ型障碍常因抑郁发作阶段症状相似而难以鉴别，甚至有双相Ⅱ型障碍患者在症状出现多年后确诊，对临床诊断和治疗造成极大的影响，给患者生命安全也带来潜在隐患。目前抑郁症和双相Ⅱ型障碍诊断仍依据临床症状学识别，无客观指标的支持，导致误诊率和漏诊率较高，因此探索可靠有效的生物标志物以提高抑郁症和双相Ⅱ型障碍鉴别的准确性及指导治疗策略已成为当前精神医学领域的重点和热点。基于抑郁症和双相Ⅱ型障碍的治疗方案和预后差异，目前认为两者间可能存在不同的发病机制，属于不同的疾病谱系［3］。本课题组在前期研究［4］中发现环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）反应元件结合蛋白1（cAMP responsive elementbinding 1，CREB1）基因在抑郁症和双相障碍患者脑内的表达存在差异，提示CREB1基因可能具有鉴别抑郁症和双相Ⅱ型障碍的潜在价值。因此，本研究旨在探讨CREB1基因与抑郁症和双相Ⅱ型障碍的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

纳入2015年1月—2018年12月在浙江省金华市第二医院、温州医科大学附属康宁医院、广东省韶关市粤北第三人民医院和上海交通大学医学院附属精神卫生中心住院部及门诊治疗的抑郁症和双相Ⅱ型障碍患者。入组标准：①符合美国精神病协会《精神障碍诊断与统计手册（第4版）》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders Fourth edition，DSM-Ⅳ）中抑郁症或双相Ⅱ型障碍的诊断标准。②汉密尔顿抑郁量表（Hamilton Depression Rating Scale，HAMD）评分≥17分。③抑郁症患者轻躁狂症状清单（Hypomania Check List-32，HCL-32）筛查阴性，双相Ⅱ型障碍患者HCL-32筛查阳性。④年龄18～45岁。⑤能够理解和遵守研究要求。排除标准：①既往有躁狂发作史。②脑器质性精神障碍。③精神活性物质或非成瘾物质所致精神障碍。④患有严重的躯体疾病或神经系统疾病，近期外伤或近1周内有感染或发热者。⑤沟通困难者或不合作者。选取同期在上海市徐汇区龙华街道社区卫生服务中心参加体检的健康志愿者（无中枢神经系统疾病及各种躯体疾病史、精神疾病史和精神疾病家族史）。本研究经浙江省金华市第二医院伦理委员会审核批准（审批号：2018-01-02），所有入组对象均签署知情同意书。

本研究共纳入抑郁症患者362例，平均年龄（34.0±8.7 ）岁，男性1 6 3例、女性1 9 9例，受教育年限（1 2.7 ±1.8 ）年，首发年龄（28.4 ±4.7 ）岁，病程（36.2 ±14.9 ）个月；双相Ⅱ型障碍组患者381例，平均年龄（33.5 ±7.4 ）岁，男性174例、女性207例，受教育年限（12.1 ±2.2 ）年，首发年龄（25.8 ±7.7 ）岁，病程（32.1 ±12.9 ）个月；对照组共纳入健康志愿者416例，平均年龄（35.1 ±7.4 ）岁，男性187例、女性229例，受教育年限（11.9 ±1.4 ）年。抑郁症组、双相Ⅱ型障碍组分别与健康对照组比较，性别（χ2=0.01 ，P=0.958 ；χ2=0.04 ，P=0.831 ）、年龄（t=-1.13 ，P=0.258 ；t=-0.22 ，P=0.782 ）及受教育年限（t=0.64 ，P=0.517 ；t=0.11 ，P=0.912 ）间的差异均无统计学意义。

1.2 DNA提取和位点选择

采集每位入组对象的静脉血2m L，乙二胺四乙酸抗凝备用，采用离心柱型基因组DNA试剂盒（DP304型，北京天根生物有限公司）提取外周血白细胞全基因组DNA。CREB1基因标签单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）选择参考本课题组前期工作［5］，简述如下：根据HapMap基因型数据库中的中国北京汉族人群数据进行SNP标签选择；根据条件决定系数r2＞0.8 ，最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）＞20%，筛 选 得 到2个SNP标 签rs10932201和rs3770704；采用单碱基延伸法（SNaPshot）SNP分型技术对rs10932201和rs3770704位点进行分型。实验流程同前，所有样本按10%比例随机重复进行质量控制，结果显示基因分型结果重复率为100%。

1.3 基因表达数量性状分析

采用英国脑表达联盟（United Kingdom Brain Expression Consortium，UKBEC）的公共在线数据库BRAINEAC（http：//peana-od.inf.um.es：8080/UKBECv12/）分析SNP对脑内CREB1基因表达数量性状（expression quantitative trait loci，eQTL）的影响。该数据库对10个以上的大脑脑区进行mRNA定量，研究人脑多个区域基因表达的调节和选择性剪切。

1.4 统计学方法

采用Epidata 3.0.2 软件建立数据库，用双人录入法进行数据输入和逻辑检错。使用SPSS 17.0 统计软件对数据进行分析。定量资料用x±s表示，采用t检验分析进行组间比较。定性资料以频数表示，组间比较采用χ2检验。Hardy-Weinberg吻合度检验运用在线软件（http：//www.kursus.kvl.dk/shares/vetgen/Popgen/genetik/applets/kitest.htm）计算。Hardy-Weinberg检验中P＞0.05 表示符合平衡检验。采用SHEsis遗传分析软件进行单位点遗传关联分析，分别比较组间各SNPs的等位基因和基因型频率差异。使用Haploview 4.1 软件进行连锁不平衡分析，并构建单倍型，用r2值衡量各SNP位点间的连锁不平衡程度。采用双侧检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡和连锁不平衡检验

抑郁症组、双相Ⅱ型障碍组与对照组CREB1基因rs10932201和rs3770704位点基因型的观察值和期望值Hardy-Weinberg平衡吻合度均良好（P＞0.05），表明本研究收集到的样本来自大的群体，个体间随机分配，不存在明显自然选择、迁移等因素对遗传平衡的影响，具有群体代表性。连锁不平衡分析结果显示rs10932201和rs3770704位点之间具有较强的连锁不平衡（r2＞0.4 ），且位于同一区块内（图1）。

图1 抑郁症组和双相Ⅱ型障碍组CREB1基因标签SNP位点之间的连锁不平衡Fig 1 Linkage disequilibrium between the tagSNPs of CREB1 gene in the depression group and bipolar disorder type Ⅱ group

2.2 抑郁症组、双相Ⅱ型障碍组与对照组CREB1基因rs10932201和rs3770704位点多态性比较

在CREB1基因rs10932201位点，双相Ⅱ型障碍组与对照组等位基因分布频率相比，差异具有统计学意义（χ2=4.27 ，P=0.042 ），抑郁症组与对照组等位基因分布频率相比，差异无统计学意义；抑郁症组、双相Ⅱ型障碍组分别与对照组基因型分布频率比较，差异无统计学意义（表1）。在CREB1基因rs3770704位点，无论是等位基因还是基因型分布频率，抑郁症组、双相Ⅱ型障碍组分别与对照组比较，差异均无统计学意义（表2）。

表1 抑郁症和双相Ⅱ型障碍组分别与对照组CREB1基因rs10932201基因型和等位基因频率分布比较（n，%）Tab 1 Comparison of genotypic and allelic frequencies in rs10932201 loci of CREB1 gene between the depression，bipolar Ⅱ disorder and control groups，respectively（n，%）

表2 抑郁症和双相Ⅱ型障碍组分别与对照组CREB1基因rs3770704位点基因型和等位基因频率分布比较（n，%）Tab 2 Comparison of genotypic and allelic frequencies in rs3770704 loci of CREB1 gene between the depression，bipolar Ⅱ disorder and control groups，respectively（n，%）

2.3 CREB1基因rs10932201和rs3770704位点之间单倍型分析

表3显 示CREB1基 因rs10932201和rs3770704位 点之间构建的单倍型中，A-T单倍型在双相Ⅱ型障碍组中分布频率为57.5%，与对照组相比差异具有统计学意义（χ2=4.07 ，P=0.044 ），其余单倍型分布频率在抑郁症组或双相Ⅱ型障碍组中与对照组相比差异无统计学意义。

表3 CREB1基因rs10932201和rs3770704位点单倍型与抑郁症和双相Ⅱ型障碍的相关性Tab 3 Association of CREB1 gene rs10932201 and rs3770704 haplotypes with depression and bipolar Ⅱ disorder groups

2.4 rs10932201位点与脑内CREB1基因表达的关系

eQTL分析结果显示，rs10932201位点在颞叶皮层（temporal cortex，TCTX）内与CREB1基因表达显著相关（P=0.048）（图2）。

图2 rs10932201位点对各脑区CREB1基因表达的影响Fig 2 Effect of rs10932201 on expression of CREB1 gene in different brain regions

3 讨论

既往研究［2］报道环磷酸腺苷通路、丝裂原活化蛋白激酶通路、钙依赖蛋白激酶和葡萄糖合激酶通路3通路形成了CREB的上游通路，CREB作为这4条通路的交汇点调节其下游通路脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）等基因的表达，影响神经可塑性和大脑功能。CREB1基因是CREB的编码基因，定位于染色体2q32-q34区域。前期多项研究［6-8］报道，CREB1基因与抑郁症和双相障碍有关，而且CREB1基因多态性在欧洲人群和中国汉族人群呈现明显的分布差异。本课题组最近一项研究［4］显示，CREB1基因mRNA表达水平在抑郁症和双相障碍患者中的差异有统计学意义。本研究结果显示CREB1基因rs10932201位点与抑郁症无显著性关联，这与之前的研究［9］结果一致，抑郁症核心家系研究也发现CREB1基因rs10932201位点与抑郁症无显著性关联。然而，本研究发现CREB1基因rs10932201位点G等位基因分布频率与双相Ⅱ型障碍有关，提示rs10932201位点可能影响了双相Ⅱ型障碍的发生风险；单倍型分析也显示CREB1基因rs10932201和rs3770704位点之间构建的A-T单倍型仅与双相Ⅱ型障碍具有显著性相关；进一步的eQTL分析显示rs10932201位点多态性影响TCTX的CREB1基因mRNA表 达量，提示rs10932201位点多态性具有生物学功能，可能是双相Ⅱ型障碍发生的风险因子。

神经影像学研究［11］显示，未服药的双相抑郁患者TCTX功能明显下降。TCTX参与多种神经认知加工过程，如执行功能等［12］。既往研究［13］报道rs10932201位点与场景记忆和执行功能有关，该位点的变异与个体认知的水平直接相关。因此，rs10932201位点多态性可能通过影响TCTX中CREB1基因mRNA表达水平导致CREB水平变化，进而影响下游BDNF通路。本课题组在前期研究［14］中发现BDNF与双相Ⅱ型障碍有关。那么，在基因水平上CREB1基因与BDNF基因在双相Ⅱ型障碍的发生过程中是否存在交互作用有待于进一步的研究。

本研究存在一定局限性：首先，本研究作为遗传学研究，样本量较小，未来有必要扩大样本量开展深入研究。其次，本研究选择的标签SNP最小等位基因频率设为大于20%，难以全面覆盖CREB1基因。综上所述，本研究结果显示CREB1基因rs10932201位点与双相Ⅱ型障碍有关，可能是双相Ⅱ型障碍发生的风险因子，但与抑郁症无关。在后续研究中我们将继续扩大SNP选择范围，尤其是稀有突变，以验证本研究结果，并进一步揭示CREB1基因在双相Ⅱ型障碍发病机制中的作用。

参·考·文·献

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