跑轮运动对小鼠皮质神经元AKT/mTOR通路活性及运动诱发电位的影响

易凌荣，谭波涛，詹祖雄，刘 媛，殷 樱，虞乐华

1.重庆医科大学附属第二医院康复医学科，重庆 400010；2.陆军军医大学大坪医院野战外科研究部，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400042

众所周知，中枢神经系统（central nervous system，CNS）损伤的修复是当今医学界的难题。脊髓损伤、脑损伤导致的大量轴突断裂、脱髓鞘等改变是导致CNS损伤患者出现持久性功能丧失的重要原因。研究［1-3］表明，激活蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PKB/m TOR，AKT/m TOR）信号通路可有效增强神经元的合成代谢，促进细胞存活，提高内源性轴突的再生能力。亦有研究［4］发现，激活m TOR通路可促进少突胶质前体细胞的增殖和分化，诱导髓鞘发育。因此，对中枢神经元m TOR通路的调控有望成为脊髓损伤等疾病的重要治疗靶点之一。既往研究［2-3］显示，学者们多以敲除磷酸酶及张力蛋白同源物（Phosphatase and tensin homolog，Pten）基因的方式调控m TOR通路。而由于Pten是一种肿瘤抑制基因，敲除后或将增加肿瘤的发生风险，因此寻找贴近临床的生理性干预方式显得尤为重要。

运动是现代康复的核心。对于CNS而言，跑步训练不仅能增加皮质、海马和纹状体等多个区域内的脑血流量，诱导脑血管生成，增加成年神经发生，还能够增强神经干细胞的增殖、存活和分化，降低神经退行性变的风险［5］。新近研究［6-8］显示，跑步训练后啮齿动物的血管内皮细胞、肌肉细胞和神经细胞中的AKT/m TOR通路存在被激活的现象。但该运动能否激活皮层神经元AKT/m TOR通路以及何种强度具有更好的激活效应，仍有待进一步探索。基于此，本研究通过不同强度的跑轮训练，探究其对成年小鼠皮质神经元AKT/mTOR通路激活的影响，以期为CNS损伤患者制定运动策略提供一定的理论依据。

1 对象与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器

6～8周龄健康成年雌性C57BL/6J小鼠24只［购自重庆恩斯维尔生物科技有限公司，动物生产许可证：SCXK（湘）2019-0004］，体质量为20～25 g。该小鼠于清洁级环境下分笼饲养，使用许可证：SYXK（渝）2018-0003。于20～25℃、相对湿度40%～60%、保持12 h昼夜节律的条件下，小鼠按时摄入食物和水。本研究经重庆医科大学附属第二医院伦理委员会审批［审批号：2020年科伦审第（161）号］，所有研究操作均遵守《医学实验动物管理实施细则》的要求。

BCA蛋白定量试剂盒（Thermo，美国），脑源性生长因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗 体、AKT抗体、磷酸化AKT（p-AKT）抗体、核糖体蛋白S6（ribosomal S6 protein，S6）抗体、磷酸化S6（p-S6）抗体（CST，美国），胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）抗体（上海优宁维生物科技股份有限公司），β-肌动蛋白（β-actin）抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）。

小型垂直电泳仪（Bio-Rad，美国），化学发光成像仪（上海天能科技有限公司），PowerLab/16SP诱发电位仪（ADInstruments，澳大利亚），小鼠转轮式疲劳仪（济南益延科技发展有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 分组和跑轮训练24只雌性小鼠被随机分为对照组、低运动强度（low exercise intensity，LEI）组、中等运动强度（moderate exercise intensity，MEI）组、高运动强度（high exercise intensity，HEI）组，每组6只。

跑轮训练共分为2个阶段，包括3 d的预训练和1周的正式训练。预训练期间，小鼠每日以6m/m in的速度运动15m in；在最后1次训练结束后，测试小鼠的最大运动速度，即在原速度基础上每间隔3m in增加0.6m/m in，逐渐增加速度直至小鼠被电击10次后无法继续训练（认为其达到耗竭）。正式训练期间，LEI组小鼠以50%的最大速度、MEI组以75%的最大速度、HEI组以100%最大速度分别进行训练［9］，每日运动15m in；而对照组小鼠被放入跑道中，不进行跑步训练。

1.2.2 上肢运动诱发电位检测 采用0.5%戊巴比妥钠对运动后的4组小鼠进行麻醉，剔除头颅顶部和右上肢毛发。切开顶部皮肤，用牙科钻钻开头颅左侧感觉运动皮质区域颅骨，暴露出硬脑膜。将小鼠固定于立体定位仪上。刺激电极经颅骨钻开区域轻触左侧感觉运动皮质区域硬脑膜，一对针状记录电极插入右上肢肱二头肌中，参考电极固定于头皮切口边缘，地线接小鼠尾部。以频率4 Hz、波宽0.2ms、强度5.0mA的电流刺激小鼠，检测其右上肢运动诱发电位（motor evoked potential，MEP）。每次检测重复3次，获得稳定波形后记录各波峰潜伏期，以反映神经传导情况。

1.2.3 运动皮质组织蛋白提取 取小鼠运动皮质，称重后放入预冷的匀浆器中，加入适量的裂解液（每1mg组织对应5μL裂解液），充分研磨至乳白色悬液后转至离心管中。经超声破碎（300W破碎2 s，间隔10 s，持续1m in）后，将组织悬液静置45m in。于4℃、15 000×g下离心15m in，将上清液转至另一离心管中，即为运动皮质组织总蛋白样品，使用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。1.2.4 运动皮质AKT/m TOR通路中关键蛋白和生长因子检测 采用蛋白质印迹（Western blotting）对小鼠运动皮质AKT/m TOR通路中的关键蛋白和生长因子进行检测，具体操作详见说明书。实验中使用的一抗为AKT抗体（1∶1 000）、p-AKT抗 体（1∶1 000）、S6抗 体（1∶1 000）、p-S6抗体（1∶1 000）、IGF1抗体（1∶500）、BDNF抗体（1∶1 000）和β-actin抗体（1∶2 000），使用二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1∶2 000）和山羊抗兔IgG（1∶3 000）。最终，于全自动化学发光图像分析系统进行显影和条带分析。

1.3 统计学方法

采用Graphpad Prism 8.0.2 和SPSS 20.0 软件进行统计分析。定量数据以x±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，并采用Bonferroni检验进行校正。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 上肢M EP检测分析

运动训练1周后，MEP检测结果（图1）显示，4组小鼠右上肢MEP的N1波、P1波潜伏期间均存在较大差异（P=0.000 ，P=0.015 ）。与对照组相比，3个运动组小鼠的N1波潜伏期均有所缩短（均P＜0.05）；与HEI组相比，LEI组小鼠的N1波潜伏期更短（P=0.032）。同时，与对照组相比，LEI组小鼠的P1波潜伏期较短（P=0.015）。

图1 4组小鼠上肢MEP分析Fig 1 Analysis of upper limb MEP in the four groups of mice

2.2 运动皮质AKT/m TOR通路中关键蛋白的表达分析

Western blotting检测结果（图2）显示，经跑轮训练后，4组小鼠运动皮质中p-AKT、p-S6表达间均存在显著差异（均P＜0.05）。与对照组相比，LEI组小鼠p-AKT/AKT比值较高（P=0.009），且MEI组和HEI组的p-AKT/AKT亦也有增加（均P＜0.05），但3个运动组间差异无统计学意义；同时，与对照组相比，该3个运动组小鼠的p-S6/S6均有增加（均P＜0.05），且LM I组高于MEI组高于HEI组，但运动组间差异亦无统计学意义。

图2 Western blotting检测4组小鼠运动皮质中AKT/m TOR通路的关键蛋白表达Fig 2 Expression of key proteins of AKT/m TOR pathway in the motor cortex of the four groups by Western blotting

2.3 小鼠运动皮质AKT/m TOR通路中生长因子的表达分析

Western blotting检测结果（图3）显示，与对照组相比，LEI组小鼠运动皮质中IGFI、BDNF和脑源性神经营养因子的前体（precursor of BDNF，pro-BDNF）的表达均较高（均P＜0.05）。

图3 Western blotting检测对照组和LEI组小鼠运动皮质中生长因子的表达Fig 3 Expression of growth factor in the motor cortex of mice in the control group and LEI group by Western blotting

3 讨论

运动强度是运动效果的重要影响因素之一。本课题组前期采用偏技巧性的低强度训练（即单粒小丸抓取训练）刺激脊髓损伤小鼠，结果发现小鼠皮层神经元m TOR通路无明显激活现象［10］；继而说明刺激m TOR通路需要一定的全身性肌肉调动，同时也提示跑步运动可能是成年小鼠更为理想的训练方式。有学者发现，脑血流量可随着跑步运动强度的增加而增大，当达到最大运动强度的60%后，脑血流量将出现平稳期甚至逐渐下降［11］；继而说明，超过一定的运动强度机体可能不会有更好的获益。另有研究［12］显示，低强度运动训练时乳酸的表达量可稍高过其阈值，这对提高生长相关蛋白43（growth associated protein，GAP43）的表达有较好的效果，说明低强度是促进神经再生的理想强度；而高强度运动训练会产生过多的乳酸和皮质酮，从而抑制GAP43的表达。Cobianchi等［13］研究显示，低强度至中强度运动后啮齿动物腰髓BDNF的表达有所增加；而高强度跑步训练后，其背根神经节及脊髓中的BDNF水平均会降低。该结果提示，低至中等强度的运动比高强度更能促进神经生长因子的表达，有助于神经发生，而高强度的运动可能会对神经系统产生有害作用。本研究结果也发现，低强度的跑轮运动对小鼠皮质神经元的AKT/m TOR通路有较好的激活作用，未来还需对CNS损伤状态下该强度的训练是否存在类似作用进行探究。

神经营养因子的释放是运动训练中重要的正向效应，其核心因子BDNF和IGF1可通过与相对应的酪氨酸受体激酶B受体和IGF1受体结合介导酪氨酸残基的自磷酸化，激活下游的AKT/mTOR通路［14-15］，从而调节蛋白质形成、脂质合成和转录等细胞生物学过程，在成体神经元的存活、生长、神经发生和轴突再生等方面发挥重要作用［16-18］。本研究结果显示，低强度运动训练可上调运动皮质中IGF1和BDNF的表达水平；继而表明，皮质神经元AKT/m TOR通路在跑轮训练后被激活，可能与生长因子IGF1和BDNF含量的升高有关。

本研究的神经电生理结果显示，低强度跑轮训练对提高小鼠神经传导具有积极作用。CNS的传导时间与髓鞘的功能密切相关，轴突无髓间隙的髓鞘化可引起传导速度提升［19］。近年有学者发现，3周的跑步训练可增强大鼠运动皮质少突胶质前体细胞的增殖能力，促进该类细胞向成熟少突胶质细胞分化，有利于轴突髓鞘形成［12］。本研究发现跑轮训练可缩短MEP的潜伏期，究其原因，可能是由于生长因子通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路诱导髓鞘厚度增加，从而提高了神经传导速度所致。未来，有关跑轮训练对髓鞘的影响还需行进一步的验证。

综上所述，跑轮运动可激活小鼠运动神经元AKT/m TOR通路，增强神经传导；且低强度的运动效果更好，或可作为临床上运动训练强度选择的参考。后续，相关研究还需在具体的疾病模型中探索运动强度对神经可塑性和功能恢复的机制和作用，以期为临床上CNS损伤的患者运动治疗提供新的理论基础。

参·考·文·献

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