驼乳中产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选鉴定及其酶学特性分析

韩明明，褚宇欣，关 波，胡有贞，李 谞，倪永清

（石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000）

低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides，GOS）是以乳糖或半乳糖为还原性末端，通过β-糖苷键连接一个或多个半乳糖单元形成的低聚糖混合物[1]，是一种能调节肠道微生物菌群赋予宿主健康益处的益生元[2]。现有研究表明，GOS能促进人体肠道中的有益菌（如乳酸菌和双歧杆菌）最大限度地发挥其功能，促进肠道蠕动[3]，减少肠道疾病的发病率[4]，延长肾衰竭患者的生命[5]，降低婴幼儿在遗传方面的疾病发生率等[6]。GOS具有模拟人乳寡糖的生理功效，是目前婴幼儿配方奶粉的重要成分[7]。据估计，GOS全球每年消费量在20 000 t左右，并以每年10%～20%的比例增长[8]。

GOS获取途径目前还十分有限，主要通过酶法合成，利用具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶催化乳糖反应制得。β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23），俗称乳糖酶，除了具有水解乳糖的功能，还能够在一定条件下以乳糖作为半乳糖基受体，催化合成具有不同聚合度和糖苷键类型的GOS[9]。乳糖浓度、水活度、温度、pH值等反应条件及β-半乳糖苷酶本身的特性均会影响以乳糖为底物反应合成GOS的得率[10]。不同微生物来源的β-半乳糖苷酶对转糖基反应受体的选择性也存在差异，酶源很大程度上决定了合成GOS产物的聚合度及糖苷键类型[5,11]。因此，近些年寻找安全、高效制备GOS的微生物新酶源成为研究热点[12]。

乳酸菌为公认安全（Generally Regarded as Safe，GRAS）菌株，其作为高转糖苷活性β-半乳糖苷酶的产酶菌株具有独特优势和价值[13]。到目前为止，利用乳酸菌β-半乳糖苷酶合成GOS的研究主要集中于Bifidobacteriumspp.、Lactobacillus plantarum、L.reuteri、L.paracasei及L.sakei等[14-18]。L.kefiri相比其他异型乳酸发酵Lactobacillus类群的来源更为有限，主要从开菲尔粒、啤酒及开菲尔饮料中分离获得[19]。近年有研究报道从哈萨克斯坦的驼乳中分离获得了L.kefiri[20]，但源于L.kefiri的β-半乳糖苷酶合成GOS特性的研究尚未见报道。L.kefiri作为传统食品发酵微生物具有良好的安全性，已被欧盟食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）列入安全资格认定名录（Qualified Presumption of Safety，QPS）[21]。此外，L.kefiri具有较强的耐胆盐能力，与GOS共同作用能有效抑制Listeria monocytogenes等病原菌的生长[22]，具有良好的益生潜能[23-25]。L.kefiri的这些特性对于开发安全、高产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株并应用于GOS的合成及开发合生元产品将具有独特的优势。

本研究从采自新疆沙湾县的驼乳样品中筛选获得1 株产转糖基活性β-半乳糖苷酶的L.kefiri菌株，对其产酶条件、酶学性质及以乳糖为底物合成GOS的反应条件及产物成分进行分析，旨在为丰富转糖基活性β-半乳糖苷酶产酶菌株的来源，进一步开发利用乳酸菌β-半乳糖苷酶高效合成GOS奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

驼乳和骆驼酸乳均为新疆维吾尔自治区沙湾县西戈壁镇采集。样品于无菌采样袋中低温保存且当日运回，于冰箱4 ℃保存。

1.1.2 培养基与试剂

MRS培养基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，牛肉膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸钠5 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，柠檬酸铵2 g/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L，吐温-80 1 mL/L，琼脂粉20 g/L，蒸馏水1 000 mL（pH 6.2～6.4），121 ℃灭菌15 min。

5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖（X-Gal）、邻硝基苯-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenylβ-D-galactopyranoside，o-NPG） 生工生物工程（上海）股份有限公司；Silica gel 60 No.553薄层层析（thin layer chromatography，TLC）板 美国默克公司；其他试剂均为国产分析纯。

X-Gal溶液：用二甲基甲酰胺溶解X-Gal配制成20 mg/mL的贮存液，于－20 ℃避光贮存。

o-NPG溶液：将250 mg邻硝基苯-β-D-半乳糖苷用80 mL反应缓冲溶液溶解，再用100 mL容量瓶摇匀定容，于－20 ℃保存。

1.2 仪器与设备

X7酶标仪 美国BioTek公司；LC-10A高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）、RID-10A示差检测器 日本岛津公司；糖分析柱Hi-Plex Na Column（300 mm×7.7 mm） 美国Agilent公司；TC-512聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪 英国Techne公司；5810R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；2Y快速组织细胞破碎仪 天津欧诺仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品初筛、纯化及保藏

在超净工作台中量取等分适量样品于装有灭菌生理盐水的锥形瓶内，振荡摇匀，即10－1的样品稀释液。用灭菌生理盐水的试管梯度稀释至10－5，分别取100 μL稀释液（10－3、10－4、10－5）均匀涂布到添加X-Gal以乳糖为碳源的MRS初筛平板上，37 ℃培养1～2 d，以菌落蓝白色进行初筛，挑取蓝色菌落在相同培养条件下纯化3 次。初筛菌株分别采用斜面和甘油法保藏。

1.3.2 粗酶液制备及酶活力测定

1.3.2.1 粗酶液制备

参考李琦等[26]的方法，略有修改。挑取活化后平板上的蓝色单菌落接种于MRS液体培养基中，37 ℃、160 r/min培养24 h，4 ℃、8 000 r/min冷冻离心收集菌体，用pH 6.5、0.05 mol/L磷酸盐缓冲液等体积重悬，加入1 mg/mL溶菌酶反应3 h，移入含200 μm酸洗玻璃珠的击打管内，细胞破碎仪击打（0～4 ℃，击打48 s，停58 s，共320 s，击打4 次），8 000 r/min离心10 min，所得上清液即为粗酶液。

1.3.2.2β-半乳糖苷酶活力及蛋白含量的测定

参考王丽军等[27]的方法。取50 μLo-NPG（pH 6.5、0.05 mol/L磷酸盐缓冲液配制）与50 μL粗酶液加入酶标板孔中，37 ℃反应10 min后加入200 μL 0.5 mol/L碳酸钠溶液终止反应，静置5 min后，可见明显黄色，用酶标仪测其420 nm波长处的吸光度，计算酶活力。酶活力单位定义：1 min催化水解o-NPG生成1 μmol邻硝基苯（o-nitrophenyl，o-NP）消耗的酶量为1个酶活力单位（U）。

蛋白含量测定：参照Bradford法，以牛血清白蛋白为标准蛋白。取20 μL酶液与200 μL考马斯亮蓝G-250溶液加入酶标板孔中，室温下反应5 min后，用酶标仪测其595 nm波长处的吸光度，对照标准曲线计算蛋白含量（mg）。

比活力为单位质量蛋白的酶活力，用U/mg表示。

1.3.3 产酶菌株的鉴定

1.3.3.1 形态学和生理生化鉴定

将筛得菌株接种于MRS培养基37 ℃培养至长出单菌落，培养过程对菌落的色泽、大小、形状、透明度等特征进行观察记录。涂片，进行革兰氏染色，镜检观察。参考《伯杰细菌鉴定手册》对筛得菌株进行鉴定，以糖发酵实验、淀粉水解实验、过氧化氢酶实验、明胶液化实验和硫化氢实验结果比较其生理生化特性。

1.3.3.2 分子生物学鉴定

提取产β-半乳糖苷酶菌株基因组DNA，用细菌16S rRNA基因的通用引物27f和1492r进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果，PCR产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司，进行通用引物27f和1492r的双向测序，将测序结果从NCBI-BLAST进行同源性比对分析，依据数据库中相关种属序列，建立系统发育树，进化距离的计算采用Neighbor-Joining法，在MEGA 6.0软件中用p-distances和Kimura-2 parameter双参数法构建，选用Bootstrap法评价进化树分支聚类的稳定性，重复1 000 次，得到产酶菌株的种属分类情况。

1.3.4 菌株产酶条件优化

1.3.4.1 碳源

将MRS培养基的碳源分别调整为1 g/100 mL乳糖、1 g/100 mL葡萄糖、0.5 g/100 mL乳糖＋0.5 g/100 mL葡萄糖、2 g/100 mL乳糖、2 g/100 mL葡萄糖、1 g/100 mL乳糖＋1 g/100 mL葡萄糖，37 ℃液体培养24 h，分别测定酶活力。

1.3.4.2 氮源

将MRS培养基的氮源分别调整为以蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、硫酸铵、尿素、蛋白胨＋酵母浸粉（1∶1）、蛋白胨＋牛肉膏（1∶1）、酵母浸粉＋牛肉膏（1∶1）、蛋白胨＋酵母浸粉＋牛肉膏（1∶1∶1）为氮源，总氮源质量浓度为1 g/100 mL，37 ℃液体培养24 h，分别测定酶活力。

1.3.4.3 发酵初始pH值的影响

选择最适碳源和氮源，在不同的初始pH 3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5条件下液体培养后测定酶活力。

1.3.4.4 发酵时间的影响

选择最适碳源、氮源及初始pH值液体培养，48 h内每隔4 h取样，测定酶活力和菌体生长量（OD600nm）。

1.3.5β-半乳糖苷酶的初步纯化

取10 mL粗酶液，在4 ℃冰浴状态下，缓慢地加入对应40%饱和度的相应量硫酸铵固体并缓慢搅拌，避免蛋白质变性产生气泡，静置过夜，4 ℃、3 000×g离心30 min，收集沉淀，加入0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）溶解，于14 kDa透析袋中透析过夜，获得初步纯化的β-半乳糖苷酶。

1.3.6 酶学特性分析

1.3.6.1 最适反应温度

取初步纯化酶液，分别在45、50、55、60、65、70、75 ℃条件下与o-NPG反应，测其酶活力。

1.3.6.2 最适反应pH值

用不同pH值的磷酸盐缓冲液分别配制pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的o-NPG溶液，取初步纯化酶液，在最适温度下分别反应，测其酶活力。

1.3.6.3 金属离子对酶活力的影响

用1 mmol/L的NiCl2、MgCl2、BaCl2、KCl、NaCl、AlCl3、CaCl2、FeCl3、FeCl2等金属离子盐溶液配制o-NPG溶液，取初步纯化酶液，最适温度下分别反应，测其酶活力。

1.3.7 转糖基反应合成GOS条件优化

1.3.7.1 转糖基反应

50 μL粗酶液与300 μL 30%乳糖溶液40 ℃反应12 h，沸水浴灭酶10 min后，取10 μL样品，用无水乙醇稀释至1%。

1.3.7.2 乳糖为底物合成GOS的反应条件优化

取粗酶液50 μL与300 μL乳糖溶液分别在不同初始乳糖质量浓度（100、200、300、400、450 g/L）、反应温度（45、50、55、60、65、70、75 ℃）及反应时间（2、4、8、12、24 h）条件下进行转糖基反应，TLC法分析其产物，最终确定乳糖为底物合成GOS的最适反应条件。

1.3.8 TLC分析

参考李正义等[28]的方法。将硅胶铝板烘干活化，将无水乙醇稀释至1%的样品混匀，用毛细管点样，层析缸中以展开剂（正丁醇∶乙醇∶水=5∶3∶2）展开，完全展开后晾干，喷雾显色剂于120 ℃烘箱中烘烤20 min显色。扫描后用软件ImageJ（https://imagej.nih.gov/ij/）对不同颜色的斑点进行初步定量分析。

1.3.9 HPLC分析

参考王丽军等[27]的方法，稍有修改。用三蒸水将灭酶后的转糖基反应产物稀释至终质量浓度为1 g/100 mL，0.22 μm滤膜过滤后，使用RID-10A示差检测器，Hi-Plex Na低聚糖分析柱，三蒸水作流动相，流速0.2 mL/min，柱温80 ℃，进样量20 μL，进行HPLC分析。参考卢丽丽等[29]的方法，根据HPLC峰面积对反应产物中各糖组分进行定量。

1.4 数据处理

酶活力测定均设置空白对照，且测定结果为3 次平行实验所得。所有数据统计均使用Excel软件，采用Origin Pro软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 产酶菌株的筛选鉴定

2.1.1 产酶菌株的筛选

在含X-Gal的MRS平板上初筛得到20 株产β-半乳糖苷酶菌株，初筛菌株的产酶水平见表1。

以液体发酵制备得到的粗酶液催化30 g/100 mL乳糖溶液反应，反应产物进行TLC分析（图1A），GOS斑点灰度扫描半定量结果如图1B所示。共筛选获得转糖基活性较强的β-半乳糖苷酶产酶菌株6 株，其中骆驼酸乳来源1 株（LS2），驼乳来源5 株（L1、L4、L6、L10、L11），选择生成GOS产物最多的L6菌株开展进一步研究。

图1 复筛菌株转糖基反应产物的TLC（A）及GOS灰度定量（B）Fig.1 TLC analysis (A) of transglycosylation reaction products obtained with β-galactosidase from selected strains and gray values of GOS (B)

2.1.2 产酶菌株的鉴定

2.1.2.1 形态学及生理生化特性

驼乳及骆驼酸乳来源菌株均能在MRS平板上生成直径1 mm左右的圆形菌落，菌落颜色为乳白色，革兰氏染色阳性，驼乳中筛选所得菌株L1～L16为杆状，骆驼酸乳来源菌株LS1～LS4为链球状。

对具有明显转糖基活性的6 株菌L1、L4、L6、L10、L11、LS2进行生理生化鉴定结果见表2。6 株菌均能发酵乳糖和葡萄糖，均不能发酵阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖，驼乳来源菌株L1、L4、L6、L10及L11都不能发酵麦芽糖、甘露糖、木糖和蔗糖，LS2则能发酵麦芽糖、甘露糖、木糖和蔗糖，6 株菌的明胶液化实验、淀粉水解实验、硫化氢实验均为阴性。

表2 产转糖基活性β-半乳糖苷酶菌株的生理生化鉴定Table 2 Physiological and biochemical identification of strains producing β-galactosidase with transglycosyl activity

2.1.2.2 分子生物学分析

对6 株产β-半乳糖苷酶菌株的16S rRNA基因序列进行BLAST比对分析，并选择同源序列进行系统进化分析。结果显示（图2），筛选菌株L1、L4、L6、L10、L11与开菲尔乳杆菌（L.kefiri）归为一支，LS2则与肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）归为一支。

图2 产β-半乳糖苷酶菌株的系统进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of β-galactosidase-producing strains

2.2 产酶条件优化

2.2.1 碳源对产β-半乳糖苷酶的影响

分析碳源对L.kefiriL6产酶的影响，分别测定菌液OD600nm及酶活力，结果见图3。以2 g/100 mL乳糖为碳源时，产酶水平最高，为（2.11±0.01）U/mL，表明该β-半乳糖苷酶为诱导酶。

图3 碳源对产β-半乳糖苷酶的影响Fig.3 Effect of carbon source on the production of β-galactosidase

2.2.2 氮源对产β-半乳糖苷酶的影响

分析氮源对L.kefiriL6产酶的影响，分别测定菌液OD600nm及酶活力，结果见图4。菌株以蛋白胨和牛肉膏为氮源时，其产酶水平为（0.58±0.01）U/mL；以蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉为氮源时，其产酶水平最高，可达（3.31±0.01）U/mL，表明酵母浸粉为该菌株产β-半乳糖苷酶的重要氮源。

图4 氮源对产β-半乳糖苷酶的影响Fig.4 Effect of nitrogen source on the production of β-galactosidase

2.2.3 培养基初始pH值对产β-半乳糖苷酶的影响

为分析培养基初始pH值对L.kefiriL6产酶的影响，以柠檬酸-磷酸盐缓冲液配制不同pH值的培养基进行发酵培养，37 ℃培养24 h，分别测定菌液OD600nm及酶活力，结果见图5。菌体生长量与产酶水平变化趋势一致，pH 5.5～6.5时，相对酶活力均达90%以上，pH 5.5时，产酶水平最高，为（2.99±0.02）U/mL。

图5 发酵初始pH值对产β-半乳糖苷酶的影响Fig.5 Effect of initial medium pH on the production of β-galactosidase

2.2.4 发酵时间对产β-半乳糖苷酶的影响

为得到L.kefiriL6的产酶曲线，将其接种至上述优化后的培养基中，37 ℃培养48 h，间隔4 h测定菌液OD600nm及酶活力（图6）。结果表明，该菌株在培养20 h产酶水平最高（（3.81±0.02）U/mL），4～20 h培养基中菌体的生长量变化趋势与产酶趋势基本一致。20 h以后，菌体生长达到稳定期，产酶量逐渐降低。

图6 发酵时间对产β-半乳糖苷酶的影响Fig.6 Effect of fermentation time on the production of β-galactosidase

2.3 β-半乳糖苷酶的初步纯化

L.kefiriL6菌株破碎所得粗酶液经饱和度40%硫酸铵初步纯化，其纯化过程的相关参数见表3。硫酸铵初步纯化的回收率为70%，比活力可达142.47 U/mg。

表3 β-半乳糖苷酶的初步纯化Table 3 Preliminary purification of β-galactosidase

2.4 酶学特性分析

2.4.1 pH值对酶活力影响

如图7所示，该酶在pH 6.0～9.0范围内活性较高，相对酶活力均能保持60%以上，pH 7.0时，该酶相对酶活力最高。pH 3.0～4.0时酶活力基本丧失。

图7 pH值对酶活力的影响Fig.7 Effect of pH on enzyme activity

2.4.2 温度对酶活力影响

如图8所示，菌株L.kefiriL6所产β-半乳糖苷酶的最适催化温度为55 ℃，这与王欣等[30]的研究结论相同。该酶催化反应的温度范围较宽，45～70 ℃均能保持50%以上相对酶活力。75 ℃时，相对酶活力降低至20%以下。

图8 温度对酶活力的影响Fig.8 Effect of temperature on enzyme activity

2.4.3 金属离子对酶活力影响

不同金属离子对菌株L.kefiriL6所产β-半乳糖苷酶的酶活力具有较为明显的影响，结果如图9所示。Mg2＋对该酶有明显的激活作用，相对酶活力约为对照的1.93 倍。Ni2＋、Ca2＋和Al3＋则对其酶活力有明显的抑制作用，而其他金属离子如Na＋、K＋、Ba2＋、Fe2＋、Fe3＋对其酶活力无明显影响。

图9 金属离子对酶活力的影响Fig.9 Effect of metal ions on enzyme activity

2.5 转糖基反应条件优化

2.5.1 乳糖质量浓度对转糖基反应的影响

如图10所示，随反应体系中初始乳糖质量浓度增加，GOS得率逐渐增加。当初始乳糖质量浓度为10 g/100 mL时，GOS得率仅3.34%（m/m，下同），乳糖残留量为0.72%（m/m，下同）；初始乳糖质量浓度升高至45 g/100 mL时，GOS得率最高达17.60%，此时，乳糖残留量为14.40%。

图10 不同初始乳糖质量浓度反应产物的TLC（A）及GOS、残留乳糖的HPLC定量分析（B）Fig.10 TLC analysis (A) and HPLC quantification of GOS and residual lactose (B) at different initial lactose concentrations

2.5.2 转糖基反应温度优化

以45 g/100 mL的乳糖质量浓度，分别在45、50、55、60、65、70、75 ℃进行转糖基反应，TLC分析其产物，结果见图11。在45～60 ℃时，均有水解产物和转糖基产物生成；65 ℃时GOS得率最高，可达26.12%；反应温度升高至75 ℃，乳糖残留量增至93.55%，GOS得率急剧降低，仅为6.92%。因此，菌株L.kefiriL6所产β-半乳糖苷酶合成GOS最适反应温度为65 ℃。

图11 不同温度转糖基反应产物的TLC（A）及GOS、残留乳糖的HPLC定量分析（B）Fig.11 TLC analysis (A) and HPLC quantification of GOS and residual lactose (B) at different reaction temperatures

2.5.3 转糖基反应时间优化

转糖基反应体系中，该酶与乳糖反应2 h即有水解产物和转糖基产物生成。转糖基反应4 h时GOS得率最高，可达31.51%（图12）。反应时间继续延长，体系中乳糖残留量不断减少，反应至24 h，乳糖的水解率达到64.52%。4 h后，GOS得率逐渐降低，反应24 h后，GOS得率仅为20.49%。因此，菌株L.kefiriL6所产β-半乳糖苷酶催化合成GOS的最适反应时间为4 h。

图12 不同反应时间转糖基反应产物的TLC（A）及GOS、残留乳糖的HPLC定量分析（B）Fig.12 TLC analysis (A) and HPLC quantification of GOS and residual lactose (B) after different reaction times

2.6 最优反应条件下转糖基产物的组成分析

将乳糖质量浓度45 g/100 mL、65 ℃条件下转糖基反应4 h的GOS产物进行HPLC分析。保留时间52.040 min的峰为半乳糖，保留时间48.393 min为葡萄糖，40.612 min为二糖（乳糖和转移二糖未分离），34.530 min为半乳三糖，16.223～30.052 min之间的峰为三糖以上的GOS成分。

根据图13各GOS组分对应的HPLC峰面积计算各GOS组分得率。最适反应条件下生成的转糖基产物中半乳糖为11.06%，葡萄糖为21.16%，二糖（包括乳糖和转移二糖）为49.78%，转移三糖为13.85%，转移三糖以上的GOS为4.15%。结合ImageJ对TLC斑点扫描结果分析，确定乳糖36.27%，转移二糖为13.51%。综上，L.kefiriL6催化合成GOS得率为31.51%，酶催化反应形成的GOS主要为转移二糖和转移三糖。

图13 转糖基反应产物的HPLC分析Fig.13 HPLC analysis of the transglycosylation reaction products

3 讨 论

β-半乳糖苷酶因其来源广泛，具有乳糖水解和转半乳糖基活性，被广泛应用于乳糖的水解和GOS的合成。一般来说，GOS得率随着乳糖质量浓度的增加而增加，其酶源和反应条件（乳糖质量浓度、水活度、温度、pH值等）对合成的GOS得率和组成有显著影响[31]。目前合成GOS的商业化β-半乳糖苷酶制剂主要来源于米曲霉（Aspergillus oryzae）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）和环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）[32]。不同来源的β-半乳糖苷酶其活性存在显著差异[33]，仍需不断寻找新酶源以高效合成GOS。

本研究从新疆沙湾县采集的驼乳样品中分离筛得6 株高转糖基活性菌株，5 株为骆驼乳来源，1 株为骆驼酸乳来源。其中，L6的产酶水平及转糖基活性均较高，结合形态、生理生化及分子生物学方法将L6菌株鉴定为L.kefiri。L.kefiriL6所产β-半乳糖苷酶的最适反应pH值为7.0，这与已报道的细菌来源β-半乳糖苷酶最适pH值一般介于6.0～7.5一致[34]。不同温度下，酶的催化活性差异显著[35]，最适温度高于50 ℃的β-半乳糖苷酶一般被称为耐热β-半乳糖苷酶[34]。已报道的耐热性较强的β-半乳糖苷酶主要有来源于Bacillus coagulans的β-半乳糖苷酶，其最适反应温度为65 ℃[36]；来源于Thermotoga maritime的β-半乳糖苷酶最适反应温度为80 ℃[37]；来源于Thermussp.的β-半乳糖苷酶最适反应温度为85 ℃[38]。L.kefiriL6所产β-半乳糖苷酶的催化反应温度范围较宽，该酶的最适反应温度为55 ℃，45～70 ℃均能保持50%以上相对酶活力，温度高达75 ℃时，相对酶活力才降至20%以下。因此，该菌株所产β-半乳糖苷酶在低乳糖乳品的加工过程中具有良好的应用前景。

L.kefiriL6菌株所产β-半乳糖苷酶在初始乳糖质量浓度为45 g/100 mL、65 ℃反应4 h，GOS得率达到最高，约31.51%，这与Vénica等[39]报道的达到最高GOS得率通常需反应1～5 h一致。随着转糖基反应时间延长，体系中乳糖残留量不断减少，反应至24 h，乳糖水解率达到64.52%，这与郑义等[40]以马克斯克鲁维酵母来源的β-半乳糖苷酶反应50 h，得到68.34%的乳糖水解率较相似。4 h后，GOS得率逐渐降低，可能是反应体系中底物乳糖的质量分数逐渐降低，转糖基反应产物不断积累，导致反应更多向水解反应方向进行[32]。本研究所得GOS得率与已报道的马克斯克鲁维酵母[40]34.70%的GOS得率和长双歧杆菌来源β-半乳糖苷酶32.50%的GOS得率[9]接近，但低于王丽军等[27]报道的L.plantarumYLBGNL-S7来源β-半乳糖苷酶43.40%的GOS得率，表明菌株的来源可能对其所产β-半乳糖苷酶的转糖基活性影响更大。L.kefiriL6菌株所产β-半乳糖苷酶在其最佳的转糖基反应条件下生成的GOS中，转移二糖约为13.51%，转移三糖约为13.85%，转移三糖以上的GOS约为4.15%；L.plantarumWCFS1[41]来源的β-半乳糖苷酶合成GOS，生成的转移二糖19%、转移三糖21%、转移四糖1.3%；L.plantarumYLBGNL-S7来源的β-半乳糖苷酶合成GOS，转移二糖和转移三糖分别为18.29%和12.95%，转移三糖以上的GOS质量分数为12.17%，不同来源的β-半乳糖苷酶合成GOS的种类及数量均存在一定差异[42-44]。

4 结 论

本研究从新疆沙湾县驼乳样品中筛选获得转糖基活性较高的β-半乳糖苷酶产酶菌株L.kefiriL6。该酶的催化反应温度范围较宽，最适反应温度为55 ℃，45～70 ℃均能保持50%以上相对酶活力；以45 g/100 mL乳糖为底物，65 ℃、pH 7.0条件下反应4 h生成的转移二糖为13.51%，转移三糖为13.85%，转移三糖以上的GOS为4.15%，该菌株为酶法合成GOS提供了新的乳酸菌酶源。