抗呋喃唑酮代谢物单链抗体基因构建及蛋白结构分析和活性鉴定

陈薪竹，王玉波，王 丹，洪艳平，杜华英，戴 棚，邓炜杰，熊建华，杨武英

（江西农业大学食品科学与工程学院，南昌市农产品加工与质量控制重点实验室，江西 南昌 330045）

兽药残留一直是影响我国食品安全问题的主要原因之一，由于我国在兽药使用和管理上存在漏洞，导致因非法使用兽药造成动物性食品兽药残留超标事件频频发生，严重影响了人体健康及我国动物性产品的出口贸易[1]。呋喃唑酮，又名痢特灵，是一种常见的硝基呋喃类药物，因其抗菌谱较宽且制备简单，常用于防治由多种致病菌引起的肠道感染、溃疡病等，也常作为畜禽类和水产动物的生长促进剂[2-3]。研究证明呋喃唑酮属于强致癌物[4]，对人体健康会造成很大威胁，目前包括中国在内的许多国家都已明确禁止其在食品性动物中使用。但是受经济利益驱使，我国非法使用的现象仍很严重，因此加强对动物性食品中呋喃唑酮的检测监控十分必要[5-6]。

呋喃唑酮的代谢物是3-氨基-2-噁唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ）。研究表明，AOZ与原药分子一样具有“三致”作用（致癌、致畸、致突变）[7-8]。呋喃唑酮在动物体内的代谢十分迅速，但其代谢物AOZ则能在动物机体内与细胞膜蛋白稳定结合后存留数周之久，当人类食用此类食品后，人体胃酸会使AOZ脱离蛋白质从而被人体吸收，对人类机体造成潜在危害。由于AOZ比母体原药更能稳定存在于动物组织中，所以药残监测部门通常将AOZ作为监测呋喃唑酮药物残留的靶标药物[9-10]。

目前，国内外用于检测AOZ的方法主要有仪器分析法[11-16]和免疫分析法[17-20]等。近年来，以抗原与抗体特异性、可逆分子识别理论为基础的免疫分析法得到迅速发展，因其成本低、操作简单、灵敏度高、可现场检测，弥补了大型精密仪器分析确证技术的不足，在食品安全监测中具有突出优势。在免疫分析方法中，抗体质量好坏直接影响检测的灵敏度和特异性。基因工程抗体的出现弥补了多克隆抗体特异性低、均质性差以及单克隆抗体制备困难、造价昂贵等缺点，大大拓宽了抗体的应用范围。其中单链抗体（single chain variable fragment，scFv）是一种由免疫球蛋白重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过连接肽构建而成的一种小分子基因工程抗体，其大小仅为普通抗体的1/6，不仅穿透力强、抗原性低，而且可通过发酵大量生产，近年来在农兽药残留免疫检测方面展示了广阔的应用前景[21-22]，是基因工程抗体研究领域的热点之一。以往AOZ残留免疫检测方法都是在传统的多抗或单抗基础上建立的[23-25]，利用基因工程scFv建立的免疫分析方法鲜见报道。本实验首先从前期获得的抗AOZ衍生物单克隆抗体阳性杂交瘤细胞1D2出发，采用重叠延伸聚合酶链式反应（splicing overlap extension-polymerase chain reaction，SOE-PCR）技术，用连接肽(G4S)3将抗体VH、VL基因连接构建完整的scFv基因，然后对其编码的氨基酸进行生物信息学分析，再把抗AOZ衍生物scFv基因转入到可溶性表达载体plip6/GN中和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）基因进行融合表达，最后采用直接竞争酶联免疫分析法（direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay，dcELISA）对该抗体进行活性检测，旨在为后续AOZ残留检测免疫分析方法的建立以及抗体的分子修饰、改造奠定一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

包被原（AOZ-COOH-OVA）、抗AOZ衍生物单克隆抗体阳性杂交瘤细胞1D2、感受态细胞BL21（DE3）、大肠杆菌BL21（DE3）和Plip6/GN载体由本研究室制备保存；抑制药物2-NP-AOZ 美国Sigma公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、RNA提取试剂盒、cDNA第1链合成试剂盒 北京全式金生物技术有限公司；PCR引物（表1） 北京华大生物技术有限公司；DNA片段清洁试剂盒 大连宝生物公司；质粒小提试剂盒 北京天根生物技术有限公司；SfiI酶、NotI酶、T4连接酶 美国NEB公司；酶标版 美国康宁公司；其他试剂均为进口或国产分析纯及色谱纯。

表1 VH、VL和scFv的扩增引物Table 1 Primers for PCR amplification of VH, VL and scFv used in this study

1.2 仪器与设备

S1000型PCR扩增仪、蛋白电泳设备、凝胶成像系统美国Bio-Rad公司；DNA电泳设备 北京六一生物科技有限公司；核酸蛋白分析仪 美国Thermo公司；SpectraMax M2多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 总RNA提取

首先复苏培养抗AOZ衍生物单克隆抗体阳性杂交瘤细胞1D2至对数生长期，弃培养基后，用无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗；然后加入1 mLTransZol UP裂解液，吹打细胞使其脱落后转移至离心管中，再按试剂盒说明书操作提取细胞RNA，洗脱RNA经核酸蛋白分析仪测定浓度后于－80 ℃保存。

1.3.2VH和VL基因片段的扩增

第1链cDNA的合成：以RNA为模板，按试剂盒说明书配制如下反应体系：取RNA（约5 μg）3 μL，Anchored Oligo(dT)18 Primer 1 μL、2×ES Reaction Mix 10 μL、gDNA Remover 1 μL、RNase-free Water 4 μL、EasyScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，混匀，短暂离心后42 ℃反应30 min，85 ℃灭活5 s。

VL、VH基因片段的扩增：以cDNA第1链反应物为模板，分别用VH（或VL）可变区上、下游引物扩增VL、VH基因片段，反应体系：cDNA第1链反应物1 μL、VH（或VL）（For）引物0.5 μL、VH（或VL）（Rev）引物0.5 μL、2×EasyPfuPCR SuperMix 12.5 μL、RNase-free Water 10.5 μL，混匀离心后进行扩增。设置反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，步骤2～4进行30 个循环，72 ℃延伸10 min。反应结束后取PCR产物3 μL进行1%琼脂糖凝脂电泳。

1.3.3scFv基因构建

首先以VHForSfiI/VHRev Linker或VLFor Linker/VLRevNotI作为引物，通过PCR扩增得到带有SfiI、NotI酶切位点和连接肽序列的VH、VL序列。反应体系：VH（VL）2 μL、VHForSfiI（或VLFor Linker）引物1 μL、VHRev Linker（或VLRevNotI）引物1 μL、2×EasyPfuPCR SuperMix 25 μL、RNase-free Water 21 μL，混匀离心后进行扩增，反应条件同上；之后再通过SOE-PCR将带有酶切位点和连接肽序列的VH、VL片段连接起来。反应体系：带SfiI酶切位点和连接肽的VH片段7 μL、带NotI酶切位点和连接肽的VL片段5 μL、2×EasyPfuPCR SuperMix 20 μL、RNase-free Water 18 μL，混匀短暂离心后进行连接反应，设置反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，步骤2～4进行8 个循环，72 ℃延伸10 min；最后，取连接产物2 μL、VHForSfiI引物1 μL、VLRevNotI引物1 μL、2×EasyPfuPCR SuperMix 25 μL，RNase-free Water 21 μL，混合均匀，短暂离心后进行扩增反应，反应条件同1.3.2节。反应完毕后取3 μL产物进行1%琼脂糖凝脂电泳并纯化回收。

1.3.4scFv基因与表达载体的连接和扩增

分别采用SfiI酶、NotI酶对scFv基因片段、Plip6/GN表达载体酶切，并将其纯化回收，然后将抗AOZ衍生物scFv基因片段与表达载体Plip6/GN在T4连接酶作用下连接，转化至感受态细胞BL21（DE3）中，涂布LB-Amp平板培养过夜，次日挑取克隆子，提取质粒并进行PCR鉴定和酶切鉴定，对鉴定结果正确的质粒进行测序分析。

1.3.5 抗AOZ衍生物scFv结构预测分析

1.3.5.1 基因序列分析及氨基酸序列推导及比对

利用IMGT数据库中V-QUEST程序对抗AOZ衍生物scFv序列中VH、VL进行分析。得到测序结果后，先采用软件SnapGene对抗AOZ衍生物scFv基因序列进行氨基酸序列推导，再将氨基酸序列导入IMGT数据库V-QUEST程序中对scFv可变区中骨架区（framework region，FR）和决定簇互补区（complementarity-determining region，CDR）进行划分；最后进入NCBI数据库，点击Protein BLAST选项，进行氨基酸序列同源性比对，选取同源性最高的序列并分析其差异。

1.3.5.2 编码蛋白的理化性质分析

利用ExPASy Proteomics Tools在线工具中ProtParam子程序对抗AOZ衍生物scFv所编码的氨基酸全序列进行理化分析，包括该抗体的氨基酸组成、相对分子质量及理论等电点（isoelectric point，pI）等物理化学参数。

1.3.5.3 编码蛋白二级、三级结构预测

打开ExPASy Proteomics Tools在线工具，点击SOPMA子程序，将推导得到的抗AOZ衍生物scFv氨基酸全序列导入，对抗体蛋白的二级结构进行预测；然后点击SWISS-MODEL子程序，对抗体蛋白的三级结构进行模拟预测[26-27]。

1.3.6 抗AOZ衍生物scFv表达和活性鉴定

将Plip6/GN-scFv阳性克隆子接种至LB-Amp液体培养基，37 ℃、250 r/min过夜培养，次日按2%接种量接种至50 mL LB-Amp培养基，培养至对数期，加入蛋白诱导表达剂异丙基硫代半乳糖苷（0.6 mol/L）诱导表达7 h后离心收集菌体沉淀，然后加入50 μL双蒸水和等体积2×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）上样缓冲液，煮沸10 min后进行SDSPAGE检测，同时做空载体转化菌对照；然后采用dcELISA对诱导表达后菌液上清中的抗体进行活性检测，步骤如下：首先将包被抗原AMOZACOOH-OVA用碳酸盐缓冲液（pH 9.6）稀释至1 μg/mL，用于包被酶标版，100 μL/孔，于4 ℃放置过夜；然后用PBST洗涤3 次后每孔加入120 μL 5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h后烘干备用；然后取6 条封闭后的酶标板，3 列一个平行，所有列1～7孔加入不同稀释倍数抗体，第8孔为空白对照，前3 列1～8孔分别加入50 μL PBS，后3 列1～8 孔加入50 μL标准药物2-NP-AOZ（1 μg/mL），37 ℃孵育45 min，PBST洗涤5 次后加入底物溶液对硝基苯磷酸二钠100 μL显色10 min，最后加入100 μL 3 mol/L NaOH溶液终止反应，于405 nm波长下测定其吸光度。前3 列为scFv效价的测定，后3 列是对2-NP-AOZ标准品抑制作用的分析。

2 结果与分析

2.1 抗AOZ衍生物scFv基因构建

以抗AOZ衍生物单克隆抗体阳性杂交瘤细胞1D2为出发点，提取细胞总RNA后，其电泳图条带清晰（图1A），两条带分别为28S、18S，且28S约为18S的2 倍，经核酸蛋白分析仪测定，RNA质量浓度为145.206 ng/mL，A260nm/A280nm和A260nm/A230nm比值分别为1.94、1.78，纯度较高，适用于后续反转录PCR扩增抗体VH、VL基因。如图1B所示，以RNA为模板，采用VHFor、VHRev或VLFor、VLRev引物进行PCR扩增，分别得到了大小约为350 bp的VH、VL片段，通过SOE-PCR扩增后，连接肽(G4S)3将VH、VL基因片段连接，得到一条大小为750 bp的条带，符合预期判断。

图1 杂交瘤细胞总RNA电泳结果（A）和VH、VL及scFv PCR扩增结果（B）Fig.1 Total RNA from hybirdoma cells (A) and PCR amplification results of VH, VL and scFv (B)

2.2 抗AOZ衍生物scFv基因鉴定

采用VHForSfiI、VLRevNotI引物对重组子进行PCR鉴定，得到了750 bp左右的scFv基因片段（图2A）。酶切鉴定所用酶为BglI，Plip6/GN空载体上有3 个BglI酶切位点，经BglI酶切后有2 条2 000 bp左右和1 条3 000 bp左右的条带，插入目的片段后的载体经BglI酶切后有1 条2 000 bp左右和2 条3 000 bp左右的条带，由图2B酶切鉴定结果可知酶切结果正确，而且根据对测序结果的分析可知（图3），抗AOZ衍生物单克隆抗体的VH和VL基因大小分别为360 bp和345 bp，抗体VH和VL基因已由大小为45 bp的Linker连接在一起，形成了正确的抗AOZ衍生物scFv基因结构。

图2 阳性转化子质粒PCR扩增鉴定（A）和酶切鉴定（B）Fig.2 Identification of recombinant plasmid Plip6/GN-scFv by PCR (A) and restriction enzyme digestion (B)

图3 抗AOZ衍生物scFv基因全序列Fig.3 Gene sequence of scFv against AOZ derivative

2.3 抗AOZ衍生物scFv氨基酸序列推导

采用软件SnapGene对抗AOZ衍生物scFv基因序列进行氨基酸序列推导，然后通过IMGT数据库中V-QUEST程序对抗体氨基酸序列的功能区进行划分。如图4所示，抗AOZ衍生物scFv全长750 bp，编码250 个氨基酸，其中VH编码120 个氨基酸，VL编码115 个氨基酸。推导出的氨基酸序列经V-QUEST程序分析后，VH、VL序列被划分为4 个FR区和3 个CDR区。经NCBI数据库比对后发现scFvVH与序列号为ATI97769.1的鼠源抗体重链可变区高度同源（83.33%），VL与序列号为BAC56972.1的鼠源抗体轻链可变区高度同源（90.43%）。经比对发现，该scFvVH、VL与2 个高度同源序列主要是在CDR1和CDR3区有较大差异，而且CDR3区的差异最大，这说明在scFv的制备中这2 个区域的氨基酸组成可能对抗原识别作用最为关键[28]。

图4 抗AOZ衍生物scFv氨基酸序列Fig.4 Amino acid sequences of scFv against AOZ derivatives

2.4 抗AOZ衍生物scFv物理化学性质分析

根据Expasy Proteomics Tools中ProtParam子程序分析结果可知，抗AOZ衍生物scFv蛋白由250 个氨基酸残基组成，根据表2可知，其中丝氨酸含量最高，占13.6%；其次分别为甘氨酸（12.8%）、苏氨酸（9.6%）、亮氨酸（9.2%）、酪氨酸（6.8%）；半胱氨酸、蛋氨酸、组氨酸含量最低，占比分别为1.6%、1.2%、0.8%。该抗体分子式为C1192H1854N324O379S7，相对分子质量为27 012.20，理论pI值为9.13，属于碱性氨基酸。

表2 抗AOZ衍生物scFv氨基酸组成Table 2 Amino acid composition of scFv against AOZ derivatives

2.5 抗AOZ衍生物scFv蛋白的二、三级结构分析

将上述推导的抗AOZ衍生物scFv氨基酸序列导入ExPASy Proteomics Tools在线工具的SOPMA子程序中对其二级结构进行预测，发现抗AOZ衍生物scFv包含α-螺旋20 处、β-转角25 处、无规卷曲114 处，延伸带结构则有91 处。通过SWISS-MODEL子程序进行同源模建后得到抗AOZ衍生物scFv的三维结构图（图5），观察抗体模型正面俯视图（图5A）发现，抗AOZ衍生物scFv的VH、VL由连接肽相连，6 个CDR区的分布形成一个“环桶状”结构；从图5B抗体侧面图则可看出，与抗原结合的互补决定区为空穴似的“口袋状”，这符合典型scFv的空间结构，与理论上抗原结合位点的空间构象相符，理论上应该具有良好的抗原结合活性[29-30]。

图5 抗AOZ衍生物scFv三维结构模拟图Fig.5 Simulated 3D structures of scFv against AOZ derivatives

2.6 抗AOZ衍生物scFv活性鉴定

将Plip6/GN-scFv阳性克隆子接种至LB培养基培养表达后，对其进行SDS-PAGE分析。因为插入的外源抗体基因会与Plip6/GN载体自带的AP基因融合表达，抗AOZ衍生物scFv蛋白分子质量约为20～30 kDa，AP分子质量约为50～60 kDa，所以抗AOZ 衍生物scFv-AP融合蛋白分子质量大约为70 kDa。SDS-PAGE结果如图6A所示，与plip6/GN/BL21（DE3）空载体对照菌相比，plip6/GN-scFv-phoA/BL21（DE3）工程菌在分子质量55～72 kDa处出现一条新生蛋白带，该条带就是抗AOZ衍生物scFv抗体蛋白。采用dcELISA对该抗体进行活性检测，以抗体稀释倍数为横坐标，其对应A405nm值为纵坐标作图，由图6B可得，抗体稀释倍数越大，其效价列对应的A405nm值越小，由此说明scFv抗体能够识别包被抗原，还可以看出添加药物的抑制作用分析对应的A405nm值均比未加药物的效价测定对应的A405nm值小，说明药物2-NP-AOZ对抗原抗体的特异性结合产生抑制，得到的重组scFv具有活性。在最佳包被抗原浓度和scFv稀释倍数条件下得到基于此scFv的dcELISA检测方法的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）为40.23 ng/mL，与母本单克隆抗体的IC50值（31.56 ng/mL）相比，scFv的灵敏度略有下降，这可能是因为scFv大小为完整抗体的1/6，且只具有1 个抗原结合位点，而传统单克隆抗体具有2 个抗原结合位点[21]。虽然与对应的单抗相比，scFv灵敏度略有下降，但是scFv能在大肠杆菌中表达，可通过微生物发酵快速大量制备，无需细胞培养，可大大节约生产成本及时间，而亲和力则可通过后续基因的修饰、突变进行改进。因此，在食品安全免疫检测中，基因工程scFv仍然具有很大的研究价值和应用前景。

图6 重组scFv蛋白的SDS-PAGE鉴定（A）和抗AOZ衍生物scFv效价测定及抑制作用分析结果（B）Fig.6 Identification of the recombinant protein by SDS-PAGE (A) and titer and inhibition of scFv antibody against AOZ derivatives (B)

3 结 论

本研究从分泌产生抗AOZ衍生物单克隆抗体杂交瘤细胞中成功克隆获得了抗AOZ衍生物抗体的VH、VL基因，并通过SOE-PCR用连接肽(G4S)3将VH、VL基因按VH-Linker-VL形式连接，成功构建了抗AOZ衍生物scFv基因。通过分析scFv基因测序结果并对其氨基酸序列进行推导可知，scFv基因全长750 bp，其中，VH长360 bp，编码120 个氨基酸，VL长345 bp，编码115 个氨基酸，连接肽(G4S)3大小为45 bp。该抗体相对分子质量为27 012.20，理论pI值为9.13，属于碱性氨基酸。抗体二级、三级结构的预测结果表明该抗体符合典型scFv的空间结构，并且dcELISA结果也再次确认该抗体能与抗原稳定结合和特异性识别包被抗原。本研究抗AOZ衍生物scFv基因的成功构建和抗体蛋白结构预测为后续抗体蛋白纯化和动物性食品中AOZ残留检测免疫分析方法的建立奠定了一定的实验基础，也为在分子水平上对该抗体进行改造提供了一定的依据。