CdTe量子点—钌配合物—DNA适配体探针检测血小板衍生生长因子

刘宁益,邓元青,王姗,刘婷,刘学文

(湖南文理学院 化学与材料工程学院,湖南 常德,415000)

血小板衍生生长因子(PDGF-BB)是一种重要的肿瘤标志物,其在正常细胞中含量较少,可促进伤口创伤修复;而在肿瘤细胞中过量表达,导致肿瘤细胞的增殖或迁移。对其检测将有助于癌症的早期诊疗[1]。因此,有必要发展新的方法用于高灵敏、高选择性检测PDGF。

目前报道的PDGF-BB检测方法较多[2–4],如双抗体夹心酶联免疫法(ELISA),但周期长,操作烦琐。近年来,人们开始采用适配体方法用于PDGF-BB的检测,适配体与目标检测分子特异性结合性质是实现检测的基础,且该方法操作简单、易于制备、稳定性好、特异性和灵敏度高,可有效解决上述问题[5–7]。因此,发展基于适配体的方法用于PDGF-BB的高灵敏、特异性检测具有重要意义。

水溶性量子点作为一种纳米材料,已广泛用于分析检测中[8–10]。量子点用于PDGF的检测已有文献报道,但需要将适配体共价结合在量子点上[11–12]。最近研究显示,经过修饰的CdTe量子点带负电荷,可发强荧光。金属配合物带正电荷,与量子点静电结合可导致荧光猝灭。适配体与配合物的亲和力使配合物从量子点上脱落,量子点荧光恢复。当目标检测分子加入,适配体的特异性识别及高亲和力使配合物与适配体分离,再次与量子点结合,荧光猝灭,实现对目标分子的检测,从而构建基于量子点—钌配合物—适配体复合荧光探针体系。目前该复合体系已被应用于金属离子、凝血酶等的检测[13–14],但对PDGF-BB的检测研究还未见报道。本文通过优化量子点—钌配合物—适配体复合荧光探针体系,研究了该探针体系针对PDGF-BB的检测。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

UV-2600型紫外分光光度计(日本岛津公司);F7000荧光光谱仪(日本日立公司)。

钌配合物[Ru(bpy)2dppz](PF6)2(bpy=2,2’-联吡啶;dppz=二吡啶并[3,2-A:2',3'-C]吩嗪)按文献方法合成[15–16](见图 1)。CdCl2·2.5H2O、K2TeO3、NaBH4、NaOH、NaCl、3-巯基丙酸(MPA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸、二甲基亚砜(DMSO)购自阿拉丁试剂有限公司,试剂纯度均为分析纯;血小板衍生生长因子(PDGF-BB)和适配体DNA购自上海生物工程有限公司,生物级。适配体DNA序列为:5’-TGAGTTTCTCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGAG-3’。

图1 [Ru(bpy)2dppz]2+的结构

1.2 MPA修饰CdTe量子点合成

将0.2 mmol(46 mg)CdCl2·2.5H2O溶于30 mL H2O中,滴加18 μL MPA,用1 mol/L的NaOH溶液调节pH 值约为10。氩气保护下,将0.04 mol(10 mg)亚碲酸钾(K2TeO3)加入三口烧瓶,室温下搅拌5 min。再加入40 mg NaBH4,继续搅拌5 min。加热至96℃回流,得橙色溶液。测量量子点溶液的紫外可见光谱,根据式(1)和式(2)计算量子点的尺寸和浓度[17]。

1.3 量子点—钌配合物—DNA适配体探针的形成

取1 mL 62 nmol/L量子点溶液置于荧光比色皿中,滴加钌配合物溶液,测定量子点荧光,确定钌配合物的最佳浓度。在量子点—钌配合物体系基础上,滴加适配体溶液,测定量子点荧光变化,确定最佳适配体浓度。激发波长为365 nm,收集450～700 nm的荧光值,狭缝宽度均为5.0 nm。

1.4 PDGF-BB的检测

滴加不同浓度的PDGF-BB溶液于量子点—钌配合物—适配体混合溶液中,静置30 min。测定量子点荧光。

2 结果与讨论

2.1 量子点的合成条件优化及表征

为了获得具有最佳荧光的MPA-CdTe量子点,分别测定了量子点在不同反时间的紫外可见光谱和荧光光谱。如图2所示,反应时间的增加导致了量子点的紫外和荧光吸收光谱明显的红移现象。当反应时间为0.5 h时,量子点在530 nm处有最强荧光发射。因此,量子点合成最佳反应时间为0.5 h。根据公式1(a)和1(b)估算得到量子点尺寸为3.41 nm,母液浓度为24 980 nmol/L,本实验中所用的量子点均为稀释后溶液,浓度为62 nmol/L。

图2 Tris缓冲溶液(10 mmol/L,pH=7.2)中MPA-CdTe量子点不同反应时间(0.5～3 h,间隔0.5 h)的紫外可见光谱(A)和荧光光谱(B)

2.2 CdTe量子点—钌配合物—DNA适配体探针的形成

2.2.1 钌配合物对量子点的荧光淬灭及最适宜钌配合物浓度确定

钌配合物带正电荷,巯基丙酸(MPA)修饰的CdTe量子点带负电荷,将钌配合物加入到MPA修饰的CdTe量子点溶液后,两者通过静电吸引能在量子点表面上形成复合物,从而使量子点的荧光发生淬灭。图3为量子点与钌配合物[Ru(bpy)2dppz]2+作用的荧光光谱。钌配合物的加入导致量子点的荧光发生明显的淬灭,当配合物浓度达到20 μmol/L时,量子点荧光淬灭率约为88%。因此,探针体系中钌配合物的适宜浓度为 20 μmol/L。

图3 量子点在不同浓度钌配合物下的荧光光谱。[QD]=62 nmol/L,[Ru]=0～20 μmol/L。

2.2.2 DNA适配体对量子点-钌配合物体系的荧光恢复

为了获得最佳的DNA适配体浓度,向上述量子点—钌配合物溶液中滴加不同浓度的DNA适配体,测定了其荧光光谱,如图4所示。随着适配体浓度的增加,量子点在538 nm处的荧光不断增强,同时发现在619 nm处也出现了明显的荧光增强现象,这是钌配合物的荧光范围。因此可以确定:当向量子点—钌配合物体系中加入不同浓度的适配体DNA,由于DNA和钌配合物存在强相互作用,使钌配合物从量子点表面脱离,导致量子点荧光得以恢复,同时钌配合物与DNA结合也使荧光增强;当DNA浓度达到3 μmol/L时,量子点荧光恢复了约71%,可用于后续检测研究。探针体系中适配体的浓度被确定为3 μmol/L。

图4 量子点-配合物体系在不同浓度适配体下的荧光光谱。[QD]=62 nmol/L,[Ru]=0～20 μmol/L,[DNA]=0～3 μmol/L。

2.3 PDGF的检测

DNA适配体可与PDGF-BB特异性结合,既具有选择性又具有高的亲和力。当采用量子点—配合物—适配体探针检测PDGF-BB时,适配体与PDGF-BB结合,释放出钌配合物使配合物与量子点结合,而使量子点荧光淬灭,实现对PDGF-BB的检测。

为了评估该复合荧光探针对PDGF-BB的定量荧光检测能力,在上述得到的最佳实验条件下,测定了在不同浓度PDGF-BB下的量子点—钌配合物—DNA适配体的荧光光谱图。结果如图5所示,随着PDGF-BB的浓度逐渐增大,探针复合体系的荧光强度逐渐降低。当PDGF浓度达到20 nmol/L时,荧光值不再下降且有最低荧光值,荧光淬灭率(I0/I)为4.5倍。当PDGF-BB浓度在6～20 nmol/L时,探针体系荧光强度与浓度存在良好线性关系。线性方程为I=-23.73[PDGF-BB]+1151.69(R2=0.961 9),根据IUPAC推荐的方法[18],LOD=3σ/S,得到PDGF-BB的检测限为1.26 nmol/L。实验结果表明,量子点—钌配合物—适配体荧光探针体系可用于PDGF-BB的检测。

图5 (A)量子点-配合物-适配体体系与不同浓度PDGF-BB作用的荧光光谱,(B)探针体系检测PDGF-BB的工作曲线。[PDGF-BB]=6～20 nmol/L。

2.4 选择性分析

选择性是评估荧光探针的重要指标之一。为了研究所构建复合探针体系的选择性,以凝血酶、牛血清白蛋白为对照样品,考察了探针对PDGF-BB的选择性,结果如图6所示。如前所述,PDGF-BB的加入导致了量子点发生了明显的荧光淬灭。而在相同实验条件下,对照样品的浓度为PDGF-BB的10倍时,其荧光淬灭程度明显低于PDGFBB。这一结果说明,该复合探针体系基于核酸适体对PDGF-BB的特异性识别,对PDGF-BB表现出了良好的选择性,适合用于PDGF-BB的检测,有望应用于复杂样品中PDGF-BB的检测。

图6 探针体系与不同样品的荧光柱状图。[PDGF-BB]=20 nmol/L,其它样品为200 nmol/L。

3 结论

构建了一种CdTe量子点—钌配合物—DNA适配体复合探针用于PDGF-BB的检测。采用巯基丙酸作为修饰剂,水相合成CdTe量子点,通过优化反应时间、钌配合物浓度及适配体浓度,基于适配体与PDGF-BB的特异性结合实现了对PDGF-BB的选择性检测。线性范围为在6～20 nmol/L,检测限为1.26 nmol/L。该探针设计简单,不需DNA标记,避免了传统的荧光标记法,实验过程更为简便且降低了成本。实验得到的CdTe量子点—钌配合物—DNA适配体探针可用于PDGF-BB的灵敏、选择性检测。本研究结果为量子点纳米材料作为生物小分子荧光探针提供了有益的探索,具有良好的临床应用前景。