TGFB1 和TLR4 mRNA 在糖尿病肾病患者外周血单核细胞中的表达及其与病情严重度的关系

陈雪辉，王迪，孟祥雨，海洁

（新乡医学院第一附属医院内分泌科，河南 卫辉 453100）

糖尿病肾病（DN）是糖尿病常见的微血管并发症，是终末期肾病的主要原因之一[1]。 在中国，DN发病率呈现快速增长的趋势[2]。 有研究显示，DN 发生发展与机体炎性反应、 免疫系统紊乱等密切相关[3]。 转化生长因子B1（TGFB1）是介导DN 肾小球硬化的主要细胞因子。 在血管紧张素、高血糖的刺激下，糖尿病患者TGFB1 mRNA 表达被激活，引起细胞外基质集聚，导致肾小球硬化[4]。 Toll 样受体4（TLR4）是Toll 样受体成员之一，可刺激炎性因子的转录和合成，激活炎症反应系统，促进炎症因子的释放[5]。 本研究主要探讨TGFB1 mRNA 和TLR4 mRNA 在DN 患者外周血单核细胞中的表达及与病情程度的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年12月-2018年12月于本院门诊和住院治疗的186 例2 型糖尿病患者为研究对象，其中男性85 例，女性101 例，年龄39～81岁，平均55.26±7.12岁。 排除标准：⑴合并遗传性肾病、 急性肾小球肾炎等疾病患者； ⑵合并心、肝等重要脏器功能障碍者；⑶合并糖尿病其他严重并发症患者。 参照《中国2 型糖尿病防治指南（2013年版）》[6]及《糖尿病肾病防治专家共识（2014年版）》[7]中的2 型糖尿病诊断及DN 诊断、临床分期参考标准，将2 型糖尿病患者分为单纯2 型糖尿病组（A 组）62 例；早期DN 组（B 组）47 例；临床期DN 组（C 组）42 例；肾衰竭期组（D 组）35 例。 另选取同时期于本院体检的60 例健康人群作为对照组，男性27 例，女性33 例，年龄40～78岁，平均年龄54.68±6.49岁。 各组患者性别、年龄和BMI 比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表1。

表1 各组患者性别、年龄和体重指数比较

1.2 体格检查 测量所有受试者血压、 身高和体重，并计算体重指数（BMI）。 BMI=体重（kg）/身高2（m2）。

1.3 血液标本采集和临床指标检测 采集所有受试者清晨空腹肘静脉血5ml，全自动生化仪检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、空腹血糖（FBG）、血肌酐，高效液相法检测糖化血红蛋白（HbAlc）。

1.4 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测外周血单核细胞TGFB1mRNA 和TLR4mRNA 表达 使用天津灏洋生物制品科技有限责任公司的人单核细胞分离液分离外周血单核细胞，参照说明书进行操作。 采用RNA 抽屉试剂盒提取外周血单核细胞中总RNA，微量核酸仪检测RNA 的纯度和浓度。 参照逆转录试剂盒将其合成为cDNA，并以cDNA 为模板，进行扩增。扩增条件：95 ℃10 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，72℃30 s，共35 个循环。 引物序列：TGFB1 上游5'-CGAGCCCTGGACACCAATCA-3'，下 游5' -AGGCAGAAATTGGCGTGGTA -3'；TLR4上游5'-ATGAGGACTGGGTGAGAAACG-3'，下游5'-TCAAAGATACACCAACGGCTC -3'；β -actin 上游5'-GTAAA GACCTCTATGCCAACA -3'，下 游5'-GGACTCATCGTACTCCTGCT -3'。 以β-actin 为内参，2－△△Ct法计算TGFB1 和TLR4 的mRNA 相对表达水平。

1.5 统计学分析 利用SPSS.22.0 软件分析实验数据。 计量资料以均数±标准差（±s）表示。 两组间比较采用两独立样本t 检验。 多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q 检验。两组连续变量相关性采用Pearson 相关性分析。 多因素Logistic 回归分析影响DN 的危险因素。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组研究对象外周血单核细胞TLR4、TGFB1 mRNA 表达水平的比较 单因素方差分析显示，各组研究对象外周血单核细胞TLR4、TGFB1 mRNA表达水平比较差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较显示，外周血单核细胞TLR4、TGFB1 mRNA 表达水平，D 组显著高于C 组、B 组、A 组、对照组（P＜0.05），C 组显著高于B 组、A 组、对照组（P＜0.05），B 组患者显著高于A 组、 对照组（P＜0.05），A 组患者显著高于对照组（P＜0.05）。 见表2。

表2 各组研究对象TLR4、TGFB1 mRNA 表达水平的比较（±s）

表2 各组研究对象TLR4、TGFB1 mRNA 表达水平的比较（±s）

分组对照组A 组B 组C 组D 组总例数 TLR4 mRNA相对表达量50 62 47 42 35 1.05±0.08 1.26±0.11 1.84±0.19 2.25±0.23 3.12±0.34 TGFB1 mRNA相对表达量1.04±0.05 1.37±0.13 1.65±0.18 2.31±0.25 2.97±0.31

2.2 DN 患者外周血单核细胞TLR4、TGFB1 mRNA表达水平与各指标的相关性分析DN 患者外周血单核细胞TLR4 mRNA、TGFB1 mRNA 表达水平与血清TG、TC、LDL-C，FBG，全血HbAlc 等指标呈显著正相关（P＜0.05），与血清HDL-C，eGFR 等指标呈显著负相关（P＜0.05），与年龄、病程、体重指数、收缩压、舒张压等指标无显著相关性（P＞0.05）。 见表3。

表3 DN 患者TLR4、TGFB1 mRNA表达水平与各指标的相关性分析

2.3 影响DN 发生发展的多因素Logistic 回归分析血清LDL-C，FBG，HbAlc，外周血单核细胞TLR4、TGFB1 mRNA 是DN 发生发展的独立危险因素（P＜0.05），血清HDL-C 是DN 发生发展的独立保护因素（P＜0.05）。 见表4。

表4 影响DN 发生发展的多因素Logistic 回归分析分析

3 讨论

糖尿病属于代谢紊乱性炎性疾病，炎症在糖尿病并发症的发生发展中起重要作用。 TGFB1 是目前公认的肾脏促纤维化因子。 研究显示，DN 组患者血清TGFB1 水平明显高于单纯糖尿病患者，与肾脏病理改变的严重程度呈正相关,原因可能与高糖诱导系膜细胞TGFB1 mRNA 表达激活有关[8]。抑制TGFB1 等信号通路可减轻炎性反应，从而减轻和延缓肾间质纤维化[9]。 TLR4 是介导炎症反应的关键跨膜蛋白，在肾疾病中发挥重要作用。 研究显示，抑制TLR4 表达可降低高糖诱导的足细胞炎性因子表达和细胞外基质集聚，延缓DN 进展[10]。本研究显示，DN 患者外周血单核细胞中TGFB1 和TLR4 mRNA 表达均高于健康体检者，且TGFB1 和TLR4 mRNA 表达水平随着DN 患者病情的严重程度逐渐增加，不同阶段DN 患者中TGFB1 和TLR4 mRNA 表达水平差异显著，提示外周血单核细胞中TGFB1 和TLR4 mRNA 表达水平可反映DN 患者病情严重程度，对于该疾病的诊断具有重要价值。机体内升高的脂质沉积在肾小球基底膜，会刺激膜底膜细胞增殖和细胞外间质生成，导致肾小球硬化和间质损害[11]。 有报道称，脂代谢紊乱是DN的危险因素，HDL-C 降低、TG 和LDL-C 的异常升高是DN 进展的独立危险因素[12,13]，与本研究结果一致。 本研究还显示，DN 患者外周血单核细胞TLR4 和TGFB1 的mRNA 表达均与TG、TC、LDLC 指标呈正相关，与HDL-C 呈负相关。

HbAlc 是血液中红细胞内的血红蛋白与葡萄糖经非酶促反应结合的产物,其合成速度较慢而且不可逆转，HbAlc 值能反应检测前8～12 周的平均血糖水平,且与血糖升高程度及持续时间呈显著正相关，常辅助FBG 对糖尿病进行诊断，以及对糖尿病血糖控制效果进行评估[14]。 本研究显示,FBG 和HbAlc 水平升高是影响DN 发生发展的危险因素，与相关研究报道结果一致[15,16]。 DN 患者外周血单核细胞TLR4 和TGFB1 的mRNA 表达与FBG 和HbAlc 水平呈正相关，说明TLR4 和TGFB1 也可用于反映糖尿病肾病的严重程度。

综上所述，TGFB1 和TLR4 mRNA 在DN 患者中呈高表达，并且DN 患者病情越严重，其表达越高，两者均是影响DN 发生发展的危险因素。