脑血管畸形血管标本组织P16、VEGF 的表达及意义

张天祥，崔晓敏，孙鹏

（河南省安阳市人民医院神经外科，河南 安阳 455000）

脑血管畸形病是一种先天性的脑血管发育障碍或非肿瘤性发育异常性疾病，以年轻男性发病居多，会引起脑组织局部血管数量和结构的异常，并且对正常脑血流产生影响，一旦发生血管破裂出血会导致严重脑出血或血肿，甚至危及生命[1]。脑血管畸形可以发生在大脑的任何部位,主要是脑实质，也可以侵袭脑膜甚至头皮，是引起外科脑血管意外的常见原因[2,3]。 分子生物学研究表明，脑血管畸形的发生和发展是一个涉及多种因素的多阶段复杂过程，与遗传、免疫等多种因素有关，在血管形成过程中细胞增殖周期调控失常能够导致血管的异常发育，导致血管畸形的形成。 血管内皮细胞生长因子（VEGF）是具有最强的血管生成作用的细胞因子[4]，P16 是对细胞增殖及凋亡具有调控作用的细胞因子，在新生血管形成及细胞增殖过程中，VEGF 及P16 具有极其重要的作用。 为进一步探讨脑血管畸形的发病机制，本次研究选取2017年1月至2019年3月在我院治疗的脑血管畸形患者78 例，就其P16、VEGF 表达情况及其临床意义进行研究，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2019年3月在我院治疗的脑血管畸形患者78 例脑血管组织标本（观察组），其中动静脉畸形52 例，海绵状血管瘤26 例；纳入标准：⑴在我院行手术治疗，且经病理组织学确诊；⑵临床资料完整；⑶患者年龄＞18岁。 排除标准：⑴合并有恶性肿瘤、肝肾功能障碍、免疫系统疾病等；⑵非初次治疗者；⑶既往其它脑血管疾病病史。 同时选取其它疾病获取的正常脑组织血管标本30 份作为对照组，观察组和对照组病例来源患者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。 研究内容经本院医学伦理委员会批准，符合医学伦理学要求。

表1 观察组和对照组一般资料比较

1.2 实验方法 血管组织VEGF 及P16 检测采用免疫组化染色法，P16 单克隆抗体（克隆号：16P07,购自上海长岛生物技术有限公司），VEGF 单克隆抗体(克隆号JH121,福州迈新生物技术开发有限公司)。 标本用10%中性福尔马林固定。 常规脱水，透明，浸蜡，石蜡包埋，3μm 连续切片，烘烤1h（70℃），烘烤片用二甲苯及乙醇脱蜡至水化后，所有切片用柠檬酸处理，用于高温和高压抗原修复。过氧化氢消除过氧化物酶，滴加山羊血清封闭抗原，温育后加入1:50 稀释的山羊单克隆抗体工作液（P16 克隆号41D，VEGF 克隆号44H），将加湿的盒子在室温下温育1h，用PBS 缓冲液冲洗后滴生物素标记的二抗，室温温育，然后滴加生物素标记的过氧化物酶后温育。 DAB 显示颜色，苏木精复染核，中性胶密封。 为每批部分设置了明确的阳性和阴性对照。

1.3 结果判断VEGF 主要在血管内皮细胞胞浆中表达，表现为淡黄色至棕黄色团块样或颗粒样染色物质，P16 主要在血管内皮胞浆及细胞核中表达，表现为淡黄色至棕黄色团块样或颗粒样染色物质，采用半定量评价方法，每张切片随机选取10个视野，对染色强度和阳性内皮细胞比例进行评价，染色强度：无着色为0 分，淡黄色为1 分，黄色为2 分，棕黄色为3 分；阳性细胞比例＜5%为0 分，5%～25%为1 分，26%～50%为2 分，51%～75%为3分，＞75%为4 分。染色强度和阳性细胞比例得分之和≥3 分为阳性表达。

1.4 统计学处理 统计分析采用SPSS22.0 软件，计量资料采用（±s)表示，比较使用t 检验，计数资料比较使用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组和对照组P16、VEGF 表达 观察组脑血管组织标本P16、VEGF 阳性表达率明显高于对照组脑血管组织标本，比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2 和图1。

图1 免疫组化染色图

表2 观察组和对照组P16、VEGF 表达

2.2 观察组不同疾病患者P16、VEGF 表达 海绵状血管瘤P16 阳性表达率明显高于动静脉畸形（P＜0.05）；海绵状血管瘤和动静脉畸形VEGF 阳性表达率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表3。

表3 观察组不同疾病患者P16、VEGF 表达

2.3 P16 与VEGF 在脑血管畸形标本中的相互关系 相关分析结果显示，在脑血管畸形组织标本中，P16 与VEGF 表达无明显相关性（P＞0.05），见表4。

表4 畸形脑血管组织中P16 与VEGF 表达的相关性分析

3 讨论

脑血管畸形是一种先天性血管疾病,可以发生在任何年龄，但在年轻男性中更常见。 脑血管畸形可以发生在大脑的任何部位，主要是脑实质，也可以侵袭脑膜甚至头皮[1]。 病变可以是单个或多个,最常见于大脑半球的浅表部位, 其次是脑干和小脑。脑血管畸形有多种病理形式，以动静脉畸形最为常见[2]。 通常有一条或多条输入动脉和输出静脉，其中包含不同直径、 不规则形状和不同壁厚的血管，有些像动脉，有些像静脉，大多数位于大脑中动脉的分布区，通常呈楔形，尖端指向大脑深处[6]。由于病变中的血流紊乱，血管痉挛或邻近脑组织的血液循环的逐渐损伤或血管破裂，脑血管畸形可以是进行性的或暴发性的[7]。 脑血管畸形临床表现最常见的为畸形血管破裂的症状，部分患者以癫痫为首发症状，局部脑缺血可引起脑萎缩，智力下降，精神障碍等并发症[8]。 早期发现，早期诊断和早期治疗是降低患者死亡率、 严重不良并发症和住院费用的有效方法。 血管畸形的生存环境是一个动态的分子生物环境。 通过研究畸形血管中分子因子和蛋白质的变化,可以进一步了解脑血管畸形的形成，发展和破裂的可能机制。 为医务人员开发新的治疗方法提供依据,尽可能通过基因组学和化学改变病理血管的生理状态，促进血管修复，避免手术或栓塞等外伤性侵袭治疗。 近年来，随着显微外科神经外科和介入手术的应用和发展，脑血管畸形的治疗和预后有了明显改善，但脑血管畸形和发病机制的原因尚不清楚。

P16 是肿瘤抑制基因编码的蛋白质，能够对细胞的增殖及凋亡进行调控，能够调控细胞有丝分裂过程从G1 到S 期[7]，P16 在体内广泛表达，在脑组织及脑血管的上皮细胞内P16 的正常表达对于维持内皮细胞的正常增殖具有重要的意义[8,9]。在本组资料中，在动静脉畸形及海绵状血管瘤组织中，P16 的表达上调，而且均要高于正常脑组织血管的表达水平，而脑血管畸形的发生与内皮细胞的异常增殖有关，在内皮细胞异常增殖的过程中出现P16 的高表达，其可能是异常增殖导致的具有抑制增殖作用的P16 激活的结果。

VEGF 在血管的发生，发展和稳定，增殖和变性中起重要作用。 VEGF 基因长度为14kb,由7 个内含子和8 个外显子组成。 该产物是34～35kD 的同型二聚体蛋白质,并且亚基通过二硫键连接[10]。VEGF 产生五种转录因子，由23,121,165,189 和206 个氨基酸残基组成。 研究表明，VEGF 是一种血管通透因子，以内皮细胞为特异性靶点，引发一系列生理和病理生化变化，促进细胞间隙的形成，并引起继发性基质蛋白酶降解[11]。 VEGF 启动并控制许多相关细胞因子和细胞在新血管形成过程中表达蛋白质，促进微血管发芽并影响增殖血管的成熟阶段。 VEGF 是一种多功能因子，特异性作用于血管内皮细胞，对血管内皮细胞具有高亲和力，可增加血管通透性，促进内皮细胞增殖和血管生成[12]。 同时，血液中的纤维蛋白原和其他物质可以进入细胞外基质形成纤维蛋白凝胶，纤维蛋白凝胶作为基质可以促进新血管的形成和基质细胞的增殖。 VEGF 主要的生物学功能是诱导血管内皮细胞的增殖，具有高度特异性，促进血管生成和血管侧支循环的建立[13]。 作为一种血管生成因子，VEGF可能在脑缺血再灌注中发挥重要作用。

研究发现VEGF 在动静脉畸形中异常表达，这被认为是由异常血流动力学压力诱导内皮细胞过度表达引起的[14]。 可能的机制是随着血管压力的增加和异常血管中血流速度的加快，血管内皮细胞和平滑肌细胞的承压损伤增加并逐渐恶化，而平滑肌细胞可以逐渐从舒张型变为分泌型，从而逐渐增加VEGF 的分泌，从而刺激内皮细细胞的增殖，修复血管内皮细胞层，同时促进新生血管的增加，以补偿血管壁损伤引起的缺血缺氧[15,16]。

本研究发现与对照组相比，观察组脑血管畸形患者血清VEGF 浓度明显增高。 这表明脑血管畸形患者脑细胞缺血缺氧刺激局部组织释放大量VEGF。 VEGF 的作用机制是与血管内皮细胞上的特定受体结合，从而发挥其生物效应，开放侧支循环，改善脑供血功能。 随着脑供血功能的不断的改善，血清VEGF 水平也逐渐降低。

综上所述，脑血管畸形血管标本P16、VEGF表达明显上调，两者在疾病发生发展中可能通过相互调控促进血管畸形的发生发展。