小儿支气管哮喘与信号传导及转录激活因子3等位基因相关性分析

薛向东，吴迎爽，马 君，程渊博，王利红，杨素娟

张家口市第一医院 1.儿科；2.泌尿外科；3.肾内科，河北 张家口075000

支气管哮喘是小儿呼吸系统的常见病、多发病之一，14岁以下儿童发病率约为4%。支气管哮喘可严重影响患儿学习、运动、饮食，甚至睡眠[1]。目前，支气管哮喘的病因及具体发病机制仍未完全阐明，其可能与多种复杂因素有关，除环境因素诱发外，包括基因多态性在内的遗传因素也是导致该病发生发展的关键因素[2]。信号传导及转录激活因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)3属于核转录因子，与生理功能、感染及肿瘤发生有关，同时，其基因多态性可能影响多种免疫系统疾病的易感性[3-4]。本研究旨在探讨小儿支气管哮喘发病与STAT3等位基因的相关性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取自2018年1月至2021年1月于张家口市第一医院就诊的86例小儿支气管哮喘患儿纳入哮喘组。另选取同期体检的100例健康儿童纳入健康组。哮喘组中，男性46例，女性40例；年龄4～9岁，平均年龄(6.30±1.35)岁。健康组中，男性55例，女性45例；年龄5～8岁，平均年龄(6.19±1.27)岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准。所有研究对象家属均签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准 哮喘组患儿纳入标准：符合儿童变应性哮喘诊断及分度标准[5]；年龄≤14岁；自愿加入研究；临床资料完整。哮喘组患儿排除标准：川崎病；炎症性肠病；其他免疫系统疾病。健康组纳入标准：年龄≤14岁；于我院体检证实健康无疾病；近4周无感染或发热；自愿加入研究；临床资料完整。健康组排除标准：近4周使用激素或免疫抑制剂；过敏体质；其他免疫系统疾病史。

1.3 研究方法

1.3.1 DNA提取及引物设计 抽取研究对象外周静脉血2 ml，EDTA抗凝，吸取200 μl提取目标DNA，-80℃保存；引物设计和引物设计合成均由Invitrogen公司完成，包含基因多态性位点质控正向引物和通用反向引物。

1.3.2 SSP-PCR检测 SSP-PCR反应体系包括模板DNA 2 μl、2×PowerTaq Master Mix 12.5 μl、特异性引物0.5 μl、质控正向引物0.5 μl及通用反向引物1 μl，以dd H2O补足25 μl。内含子11 rs2293152位点扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s连续8个循环，60℃退火45 s，73℃延伸45 s；94℃变性30 s连续25个循环，52℃退火45 s，73℃延伸45 s，73℃延伸5 min。内含子23 rs957970位点扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s连续35个循环，50℃退火45 s，73℃延伸45 s，73℃延伸5 min。

1.3.3 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶(15 g/L)中加入PCR产物5 μl，电泳电压和时间分别设置为110 V、35 min。电泳完成后切取目标条段经凝胶成像仪显像。

1.3.4 PCR产物测序及验证 STAT3基因内含子11 rs2293152位点和内含子23 rs957970位点随机抽样3份样本，完成包含上述位点产物扩增，产物测序和验证均由英潍捷基完成直接测序，将测序SNP位点基因型结果和SSP-PCR检测结果对比验证。

1.3.5 血清炎症因子水平检测 抽取晨起空腹外周静脉血3 ml，离心(3 000 r/min、10 min)后采用ELISA法测定血清白细胞介素(interleukin，IL)-4、IL-5、γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)水平。

2 结果

2.1 H-W遗传平衡检验分析 H-W遗传平衡检验分析显示，健康组STAT3基因内含子11 rs2293152位点基因型分布频率和内含子23 rs957970位点基因型分布频率均符合H-W平衡(χ2值分别为0.700、0.255，P>0.05)；哮喘组STAT3基因内含子11 rs2293152位点基因型分布频率和内含子23 rs957970位点基因型分布频率均符合H-W平衡(χ2值分别为0.279、1.211，P>0.05)。证实纳入儿童具有人群代表性。

2.2 两组内含子11 rs2293152 C/G基因型及等位基因分布比较 哮喘组与健康组内含子11 rs2293152位点CC基因型、等位基因(C、G)比例比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。存在C等位基因的小儿支气管哮喘发生风险为G等位基因的1.62倍(比值比=1.62，95%可信区间1.10～2.89)。

表1 两组内含子11 rs2293152 C/G基因型及等位基因分布比较/例(百分率/%)

2.3 两组内含子23 rs957970 C/T基因型及等位基因分布比较 两组内含子23 rs957970位点基因型(CC、CT、TT)及等位基因(C、T)比例比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组内含子23 rs957970 C/T基因型及等位基因分布比较/例(百分率/%)

2.4 内含子11 rs2293152位点不同基因型患者血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平比较 内含子11 rs2293152位点CC、CG基因型患者血清IL-4、IL-5水平高于GG患者，血清IFN-γ水平低于GG患者，差异有统计学意义(P<0.05)。内含子11 rs2293152位点CC基因型患者血清IL-4、IL-5水平高于CG患者，血清IFN-γ水平低于CG患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 内含子11 rs2293152位点不同基因型患者血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平比较

2.5 内含子23 rs957970位点不同基因型患者血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平比较 内含子23 rs957970位点CC、CT、TT基因型患者血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 内含子23 rs957970位点不同基因型患者血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平比较

3 讨论

近年来，支气管哮喘发病率呈逐年升高的趋势，已逐渐成为全球性公共卫生问题[6]。支气管哮喘常会对儿童正常的生长发育及身心健康造成负面影响。学龄前儿童常因喘息症状就诊，根据进展阶段，临床将喘息分为一过性、持续性及迟发性喘息或哮喘3类[7]。迟发性喘息患儿如仅合并特应性因素，进展成为支气管哮喘风险较高。针对此类患儿，早期诊治有助于预防支气管哮喘发病，但如何实现早期准确的预测仍无合适的指标[8]。支气管哮喘可能属于多基因相关遗传性疾病，患儿直系亲属发病比例最高接近75%[9]。近年来，候选基因定位克隆研究不断深入，已成为分析疾病易感基因的主要方法，而支气管哮喘发病的候选基因超过200个，包括人类白细胞抗原Ⅱ、肿瘤坏死因子α及IL等，涉及到机体炎症反应、免疫识别及信号传导等多方面生物学改变[10-11]。

STAT3属于DNA结合蛋白，广泛表达于人体内多种组织及细胞，其能够在无功能状态下接收胞外信号刺激后磷酸化。磷酸化的STAT3能够进入细胞核内结合特异DNA片段，调控相关基因转录表达，影响细胞增殖分化，肿瘤及感染的发生、进展等[12-13]。有研究报道，敲除模型动物呼吸道上皮平滑肌细胞STAT3基因，经尘螨抗原刺激后，呼吸道反应性显著下降，提示STAT3可能在支气管哮喘呼吸道高反应性中发挥着一定作用[14-16]。

SSP-PCR检测技术用于基因多态性位点检测结果与直接测序法检测基本一致，且具有检测效率高，价格较为低廉等优势[17-18]。本研究通过SSP-PCR法检测STAT3基因多态性，并进一步分析该基因多态性与小儿支气管哮喘易感性的关系，结果显示，小儿支气管哮喘患儿STAT3基因内含子11 rs2293152位点和内含子23 rs957970位点均存在基因多态性，但内含子11 rs2293152位点基因型分布频率与既往研究[19]报道不一致，原因可能与纳入患儿种族和地区差异有关。

本研究中，哮喘组内含子11 rs2293152位点CC基因型、C等位基因比例显著高于健康组(P<0.05)，存在C等位基因的小儿支气管哮喘发生风险为G等位基因的1.62倍，进一步说明内含子11 rs2293152位点C/G基因型中的C等位基因可能是小儿支气管哮喘发生的易感基因，针对此类人群，早期干预有助于降低支气管哮喘发生风险。但两组内含子23 rs957970位点基因型和等位基因比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)，可基本排除内含子23 rs957970位点基因多态性对小儿支气管哮喘发病风险的影响。本研究结果显示，内含子23 rs957970位点CC、CT、TT基因型患者血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；内含子11 rs2293152位点CC、CG基因型患者血清IL-4、IL-5高于GG患者，血清IFN-γ低于GG患者(P<0.05)，CC基因型患者血清IL-4、IL-5高于CG患者，血清IFN-γ低于CG患者(P<0.05)，提示基因多态性与哮喘患者的气道炎症有关，CC基因型患者的气道炎症最为严重。有研究报道，STAT3可通过诱导细胞因子、趋化因子等介导哮喘患者的气道炎症反应，因此，STAT3基因多态性与哮喘患者气道炎症反应严重程度有较大的相关性[20]，与本研究结果一致。STAT3基因多态性对STAT3信号通路的调控作用不同，内含子11 rs2293152位点上的C等位基因可通过对STAT3信号通路较强的激活作用介导气道结构细胞或气道炎症细胞浸润，从而加重哮喘患者病情，因此，CC基因型患者的气道炎症相对更严重[21]。

综上所述，小儿支气管哮喘发病与STAT3基因多态性有关，内含子11 rs2293152位点的C等位基因属于易感基因，且该位点的基因多态性会影响哮喘患者气道炎症反应。