黄葵胶囊通过抑制Notch 信号通路减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤

黄丽丽 吴强 石伟荣 闫超

（福建中医药大学 1 附属第二人民医院肾内科,福建 福州 350003;2 附属人民医院传统病房）

糖尿病肾病是指糖尿病引起的肾脏微血管并发症，其特点是蛋白尿和肾功能进行性减退，最终进展到终末期肾病，已成为糖尿病患者死亡的主要原因之一〔1〕。黄葵胶囊的主要成分是黄蜀葵花，具有利尿通淋、消肿解毒的作用〔2〕。有研究证明，黄葵胶囊可降低糖尿病肾病循环系统免疫复合物，此外还可利水消肿和降低尿蛋白〔3〕。但黄葵胶囊对糖尿病肾病的作用和机制尚未完全阐明。本研究使用高糖刺激肾小管上皮细胞模拟糖尿病肾病体外模型，旨在探究黄葵胶囊对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的作用及其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞株:人肾小管上皮HK-2 细胞，购自美国ATCC。药品与试剂:黄葵胶囊，规格:0.34 g/粒，生产批 号:20012909，国药准 字:Z19990040。江苏苏中药业集团股份有限公司生产。DMEM 低糖液体培养基、DMEM 高糖液体培养基和CCK-8 试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司生产；胎牛血清，美国ThermoFisherScientific 公司生产；二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司生产；肿瘤坏死因子（TNF）-α 和白细胞介素（IL）-6、酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒，欣博盛生物科技有限公司生产；一抗兔多克隆抗体神经源性位点缺口同源蛋白（Notch）1，兔单克隆抗体Hes1，兔单克隆抗体蛋白锯齿（Jagged）1，兔多克隆抗体GAPDH，二抗山羊抗兔IgG H&L，英国Abcam 公司生产。仪器:PR4100 酶标仪，美国Bio-Rad 公司产品；EVOS 荧光显微镜，美国赛默飞世尔科技公司产品。

1.2 细胞分组与培养 将1 g 黄葵胶囊粉末溶于1 ml生理盐水中，制备成浓度为1 g/ml 的混悬液。根据参考文献〔4〕方法操作，将HK-2 细胞接种于含低糖（5.6 mmol/L D-葡萄糖）DMEM 的培养基中，在37℃，含5%CO2和95%空气的培养箱中培养，待细胞融合达80%时，加入0.25%胰酶消化4 min，然后取1×106个细胞接种于新的培养基，将HK-2 细胞随机分成对照组（含5.6 mmol/L D-葡萄糖）、高糖组（含25 mmol/L D-葡萄糖）、实验组（含25 mmol/L D-葡萄糖和1 g/ml 黄葵胶囊粉末混悬液）。

1.3 以ELISA 测定HK-2 细胞TNF-α 和IL-6 含量 根据参考文献〔5〕的方法，收集各组细胞上层清液，置于EP 管中，然后离心，将上清液移至新的EP管中。按ELISA 说明书要求设置空白孔、标准孔和待测样品孔。封板后于37℃孵育箱孵育，90 min 后甩干，每孔加入350 μl 洗涤液，30 s 后甩干，重复5 次。除空白孔，其余孔加入酶结合物稀释液100 μl，于37℃孵育箱孵育避光15 min 后，向每孔加入终止液100 μl，用酶标仪测量各孔450 nm 处的吸光度，根据标准曲线得出各组上清液IL-6 和TNF-α 的浓度。

1.4 以CCK-8 实验检测HK-2 细胞存活率〔6〕取各组HK-2 细胞用胰蛋白酶消化后计数，以每孔5 000个细胞的密度接种于96 孔板上，随后于每孔加入10 μl CCK-8 溶液，另设置空白孔，将96 孔板置于37℃培养箱内培养48 h 后，用酶标仪测量450 nm处OD 值，根据公式计算细胞存活率。细胞存活率=〔（实验组OD 值-空白组OD 值）/（对照组OD 值-空白组OD 值）〕×100%

1.5 以TUNEL 法检测HK-2 细胞凋亡率 根据参考文献〔7〕的方法，将HK-2 细胞接种于48 孔板，24 h后，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，弃去PBS，用免疫染色固定液固定30 min，30 min 后弃去细胞固定液，PBS 洗涤，用Triton 孵育5 min，PBS 洗涤，随后用TUNEL 工作液避光孵育1 h，用PBS 洗去TUNEL工作液，DAPI 复染，随后于每孔滴加荧光淬灭剂，最后在荧光显微镜下拍照记录。

1.6 以Western 印迹检测HK-2 细胞Notch1、Hes1、Jagged1 表达〔8〕收集对照组、高糖组和实验组人肾小管上皮细胞，于冰上加入裂解液，30 min 后刮取细胞，离心，提取上层清液为细胞总蛋白，用BCA 蛋白试剂盒定量，取50 μg 总蛋白，煮沸样本5 min，离心后上样，于12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转于聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%BSA 封闭1 h，加入一抗4℃孵育过夜，第2 天加入二抗室温孵育2 h，洗膜3 次后即用电化学发光（ECL）显色剂曝光，使用Quantity One 分析目的条带灰度值。其中一抗稀释浓度分别为:Notch1（1 ∶1 000）、Hes1（1 ∶1 000）、Jagged1（1 ∶1 000）、GAPDH（1 ∶1 000），二抗稀释浓度为1 ∶2 000。

1.7 统计学处理 采用SPSS25.0 统计软件进行One-way ANOVA 检验、LSD 检验。

2 结果

2.1 各组HK-2 细胞TNF-α 和IL-6 含量比较 与对照组相比较，高糖组TNF-α、IL-6 浓度显著增高（P＜0.05），与高糖组相比较，实验组TNF-α、IL-6 浓度显著降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组IL-6 和TNF-α 含量比较(,pg/ml,n=7)

表1 各组IL-6 和TNF-α 含量比较(,pg/ml,n=7)

与对照组比较:1）P＜0.05；与高糖组比较:2）P＜0.05

2.2 各组HK-2 细胞的存活率比较 与对照组〔（100.00±0.00）%〕相比较，高糖组HK-2 细胞的存活率〔（76.52±5.14）%〕显著降低，与高糖组相比较，实验组〔（91.33±7.12）%〕显著增高（均P＜0.05）。

2.3 各组HK-2 细胞凋亡率比较 与对照组〔（8.21 ±0.74）%〕 相比较，高糖组细胞凋亡率〔（17.43±1.26）%〕显著增高；与高糖组比较，实验组〔（11.53±1.27）%〕显著降低（P＜0.05）。见图1。

图1 TUNEL 法检测各组细胞凋亡率(DAPI,×200)

2.4 黄葵胶囊对各组HK-2 细胞Notch1、Hes1 和Jagged 1 蛋白表达的影响 对照组、高糖组和实验组Notch1 相对表达量分别为（0.92±0.08、2.33±0.17、1.32±0.11）；Hes1 相对表达量分别为（0.74±0.09、2.47±0.21、1.37±0.15）；Jagged1 相对表达量分别为（0.54±0.07、2.67±0.22、1.29±0.11）。与对照组相比较，高糖组Notch1、Hes1 和Jagged1 相对表达量显著增高（P＜0.05）；与高糖组相比较，实验组Notch1、Hes1 和Jagged1 相对表达量显著降低（P＜0.05）。见图2。

图2 各组细胞中Notch1、Hes1 和Jagged1 的相对表达

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病最常见、最严重的慢性并发症。既往研究显示炎症与糖尿病肾病密切相关，在高糖环境里，肾小管上皮细胞IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子释放会增加，直接促使肾小管上皮细胞损伤〔5〕。黄葵胶囊可用于治疗肾病综合征、糖尿病肾病、原发性肾小球肾炎〔9〕。有研究表明黄葵胶囊能通过减轻炎症反应、下调致纤维化细胞因子表达、抑制氧化应激和减少糖基化终末产物改善糖尿病肾病〔10〕。Notch 信号通路是一条高度保守的信号转导系统，该通路参与急性肾损伤、肾小球病变、肾肿瘤的发生发展过程。在糖尿病肾病中，Notch 信号通路的过度激活会导致足细胞损伤引起肾小球病变，同时还会诱导上皮间质转化调节因子Snai2 表达，促进上皮间质转化发生，引起肾小管间质纤维化〔11〕。另外，在高糖诱导的肾小管上皮细胞中，Notch 信号通路Hes1、Jagged1 和Notch1 蛋白会呈现高表达〔12，13〕。

本研究发现，黄葵胶囊会抑制高糖诱导的HK-2细胞TNF-α 和IL-6 炎症因子的分泌，同时提高HK-2 细胞存活率，抑制凋亡率，并降低Notch 信号通路中Notch1、Hes1 和Jagged1 蛋白的表达。

综上，黄葵胶囊能显著抑制肾小管上皮细胞炎症因子的分泌，并通过降低Notch 信号通路相关蛋白表达，来减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤。然而本研究仅限于体外实验，今后将开展体内实验进一步验证该结论。