丹参酮ⅡA 磺酸钠对老年COPD 模型大鼠的治疗作用及其机制

王志敏 林纯意 易高

（广州医科大学附属第五医院 1 重症医学科,广东 广州 510700;2 呼吸内科）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种常见的以持续气流受限为特征的慢性炎症性肺部疾病，以肺弹性减小、气道和肺泡结构改变引起缺氧和（或）二氧化碳潴留为主要特点〔1〕，主要累及肺实质、肺血管及气道〔2〕。COPD 后期可继发肺动脉高压，具有很高的患病率及病死率〔3，4〕。研究显示炎症反应是COPD 发生的主要原因之一，炎症细胞被激活后释放大量炎症因子浸润气道和肺组织，最终引起呼吸系统组织结构破坏，进一步参与COPD 的发生发展〔5〕。丹参酮ⅡA 磺酸钠是从丹参中分离出二萜醌类化合物丹参酮后经磺化得到的水溶性物质，具有抗氧化、抗菌抗炎、抗凝血作用和抑制气道重塑等多种生物活性〔6〕。本研究探讨丹参酮ⅡA 磺酸钠对老年COPD 模型大鼠的治疗作用及其作用机制为其在临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SD 大鼠62 只，SPF 级，雄性，22～24 周龄，体重250～300 g，由广东省动物实验中心提供，动物合格证号为SCXK（粤）2013-0002。实验开始前先适应性喂养1 w，动物房温度23～27℃，相对湿度45%～55%，昼夜时间12 h/12 h，用标准大鼠颗粒饲料喂养，自由饮用纯净水。

1.1.2 主要药物或试剂 丹参酮ⅡA 磺酸钠注射液（上海第一生化药业有限公司，国药准字H31022558）；脂多糖（LPS，美国Sigma 公司），中南海牌过滤嘴香烟（北京卷烟厂:焦油含量12 mg，烟碱量1.0 mg，一氧化碳量13 mg），肿瘤坏死因子（TNF）-α 试剂盒、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8 和IL-18（武汉博士德生物工程有限公司）；TRIZOL 试剂、逆转录试剂盒、Super Real Pre Mix Plus（SYBR Green）试剂，由天根生化科技（北京）有限公司生产；磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗体（美国BD Biosciences 公司）；RIPA 裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒、兔抗鼠β-actin 抗体、HRP-羊抗大鼠IgG、ECL Prime 蛋白印迹试剂，均购自福州迈新生物技术开发有限公司。PI3K、AKT、mTOR 和内参β-肌动蛋白（β-actin）引物设计与合成由天根生化科技（北京）有限公司完成，引物序列见表1。

1.1.3 主要仪器 -80℃超低温冰箱（青岛海尔电冰箱有限公司），自制烟雾暴露装置，Buxco 动物肺功能分析系统（北京华运安特科技有限责任公司），Thermo CL31R 型离心机（美国Thermo 公司），超微量分光光度计（北京凯奥科技公司），ABI step one荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司），GeneGenius 全自动凝胶成像系统（美国Syngene 公司），Western 印迹电泳仪（美国BIO-RAD 公司），Fluor Chem Q 蛋白印迹成像和定量分析系统（美国Alpha 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 COPD 动物模型的制备 随机选择12 只大鼠作为正常对照组，其余50 只大鼠采用气管注入LPS 和吸入香烟烟雾法制备COPD 模型。第1 天各大鼠经10%水合氯醛（100 g/0.25 ml）腹腔麻醉，气管内注射1 mg/ml LPS 100 μl，以轴位旋转大鼠数次。于第2～28 天将各大鼠在100 cm×80 cm×80 cm有机玻璃密闭箱进行烟熏，每次同时点燃香烟8 支，30 min/次，2 次/d。熏烟后立刻将大鼠移至15℃低温环境，冷空气刺激1 h，模型复制28 d 结束。造模结束后随机取2 只做肺部病理切片，确认造模成功。

1.2.2 分组与给药 造模结束时将COPD 大鼠按随机数字表分为模型对照组、丹参酮ⅡA 大剂量组、中剂量组和小剂量组，每组各12 只，另未造模的12只大鼠作为正常对照组。丹参酮ⅡA 大剂量组、中剂量组和小剂量组分别腹腔内注射丹参酮ⅡA 磺酸钠10.0 mg/kg、5.0 mg/kg 和2.5 mg/kg，正常对照组和模型对照组大鼠腹腔注射同体积的生理盐水，1 次/d，共14 d。

1.2.3 检测指标 末次给药后1 h 测定各组大鼠肺功能、支气管肺泡灌洗液中细胞计数、血清炎症细胞因子水平、肺组织PI3K/AKT 信号通路基因和蛋白的表达。

1.2.3.1 肺功能测定 各组大鼠经腹腔注射2%戊巴比妥钠0.3 ml/100 g 麻醉，仰卧位固定，暴露气管，行气管插管后与小动物肺功能检查仪器的皮管联接，测定各组大鼠肺功能指标，包括用力肺活量（FVC），第0.3 秒用力呼气容积（FEV0.3）和最大呼气流量（PEF），计算FEV0.3/FVC。

1.2.3.2 血清炎症因子水平测定 肺功能测定结束后打开腹腔并暴露腹主静脉。经腹主静脉抽血1 ml，室温下静止至血液完全凝固后离心（3 000 r/min×10 min），采用双抗体一步夹心法检测血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-18 水平。具体操作严格按照说明书进行。

1.2.3.3 支气管肺泡灌洗液细胞计数 各组大鼠脱臼处死，打开胸腔，分离气管和双肺。在气管下部做横切口，分别用止血夹关闭左、右主支气管，通过气管插管术收集肺泡灌洗液（BALF），用注射器分3次缓慢注入4℃冷PBS，2 ml/次，缓慢回吸收集BALF，回收液为80%～90%。BALF 于4℃下离心（3 000 r/min×10 min），然后用2 ml PBS 重悬细胞沉淀，采用血细胞计数板进行细胞计数，并经Wright染色对中性粒细胞和巨噬细胞进行分类计数。

1.2.3.4 RT-PCR 测定肺组织PI3K/AKT 信号通路基因的表达 取右肺后叶及副叶在液氮中研磨，加Trizol 试剂提取总RNA，用逆转录试剂盒合成得cDNA。逆转录体系:10 mmol/L 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）1 μl，随机引物2 g，5×缓冲液4 μl，二硫苏糖醇（DTT，100 mmol/L）2 μl，核糖核酸酶抑制剂（RNAsin）1 μl，莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶（MMLVRT）反转录酶1 μl。逆转录条件:37℃50 min，70℃15 min。将所得cDNA 于-80℃保存。进行PCR 前先将cDNA 室温下解冻，纯化后进行PCR 扩增。PCR 体系:cDNA 模板2 μl，目标基因上游引物和下游引物各2 μl，Super Real Pre Mix Plus 10 μl，加入纯化H2O 至20 μl。PCR 条件:95℃预变性10 s，然后以95℃10 s、90℃5 s、60℃20 s、40 个循环。以β-actin 为内参基因，采用2-ΔΔCt计算目标基因PI3K、AKT、mTOR 的相对表达量。

1.2.3.5 Western 印迹测定肺组织PI3K/AKT 信号通路蛋白的表达 取左肺后叶及副叶，切成米粒大小，加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制剂，使肺组织裂解，于4℃离心（12 000 r/min×10 min），分离得可溶性蛋白，用BCA 法进行蛋白定量，于-20℃保存。进行测量前先将蛋白室温下解冻，100℃变性10 min。取10 μl 上样，用10%十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离蛋白，转膜。用5%脱脂奶粉（磷酸化抗体用4% BSA）封闭2 h，分别加入PI3K、AKT、mTOR 和β-actin 一抗，4℃下孵育过夜。PBST 溶液洗膜3 次，加入IgG-HRP，室温避光孵育1 h，PBST 溶液洗膜3 次。加ECL 液曝光、显影、定影。用扫描仪扫描曝光胶片，用Image J 软件分析条带灰度值。

1.2.4 统计学分析 采用SPSS22.0 软件进行单因素方差分析及LSD-t检验。

2 结果

2.1 各组肺功能比较 模型对照组大鼠FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC 和PEF 均较正常对照组显著降低（P＜0.05）。丹参酮ⅡA 小剂量组和模型对照组FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC 和PEF 差异均无统计学意义（P＞0.05），丹参酮ⅡA 中剂量组FVC、FEV 0.3、FEV0.3/FVC 和PEF 均较模型对照组和丹参酮ⅡA 小剂量组显著升高（P＜0.05），丹参酮ⅡA 大剂量组FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC 和PEF 均较模型对照组、丹参酮ⅡA 小剂量组和中剂量组显著升高（P＜0.05）。见表2。

2.2 各组BALF 细胞计数比较 模型对照组BALF细胞总数、中性粒细胞和巨噬细胞均较正常对照组显著升高（P＜0.05）。丹参酮ⅡA 小剂量组和模型组BALF 细胞总数、中性粒细胞和巨噬细胞计数差异均无统计学意义（P＞0.05），丹参酮ⅡA 中剂量组BALF 细胞总数、中性粒细胞和巨噬细胞计数均较模型对照组和丹参酮ⅡA 小剂量组显著降低（P＜0.05），丹参酮ⅡA 大剂量组BALF 细胞总数、中性粒细胞和巨噬细胞计数均较模型对照组、丹参酮ⅡA 小剂量组和中剂量组显著降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组肺功能指标和BALF 细胞计数的比较(,n=12)

表2 各组肺功能指标和BALF 细胞计数的比较(,n=12)

与正常对照组比较:1）P＜0.05；与模型对照组比较:2）P＜0.05；与丹参酮ⅡA 小剂量组比较:3）P＜0.05；与丹参酮ⅡA 中剂量组比较:4）P＜0.05；下表同

2.3 各组血清炎症因子水平的比较 模型对照组血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-18 水平均较正常对照组显著升高（P＜0.05）。丹参酮ⅡA 小剂量组和模型对照组血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-18 水平差异均无统计学意义（P＞0.05），丹参酮ⅡA中剂量组血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-18 水平较模型对照组和丹参酮ⅡA 小剂量组显著降低（P＜0.05），丹参酮ⅡA 大剂量组血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-18 水平均较模型对照组、丹参酮ⅡA 小剂量组和中剂量组显著降低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组血清炎症因子水平的比较(,n=12,ng/L)

表3 各组血清炎症因子水平的比较(,n=12,ng/L)

2.4 各组肺组织PI3K/AKT 信号通路基因表达水平的比较 模型对照组肺组织PI3K、AKT1 和mTOR mRNA 表达水平均较正常对照组显著升高（P＜0.05）。丹参酮ⅡA 小剂量组和模型组肺组织PI3K、AKT1 和mTOR mRNA 表达水平差异均无统计学意义（P＞0.05），丹参酮ⅡA 中剂量组肺组织PI3K、AKT1 和mTOR mRNA 表达水平较模型对照组和丹参酮ⅡA 小剂量组显著降低（P＜0.05），丹参酮ⅡA 大剂量组肺组织PI3K、AKT1 和mTOR mRNA表达水平均较模型对照组、丹参酮ⅡA 小剂量组和中剂量组显著降低（P＜0.05）。见表4。

2.5 各组肺组织PI3K/AKT 信号通路蛋白表达水平的比较 模型对照组肺组织PI3K、AKT1 和mTOR 蛋白表达水平均较正常对照组显著升高（P＜0.05）。丹参酮ⅡA 小剂量组和模型组肺组织PI3K、AKT1 和mTOR 蛋白表达水平差异均无统计学意义（P＞0.05），丹参酮ⅡA 中剂量组肺组织PI3K、AKT1 和mTOR 蛋白表达水平均较模型对照组和丹参酮ⅡA 小剂量组显著降低（P＜0.05），丹参酮ⅡA 大剂量组肺组织PI3K、AKT1 和mTOR 蛋白表达水平均较模型对照组、丹参酮ⅡA 小剂量组中剂量组显著降低（P＜0.05）。见表4。

表4 各组肺组织PI3K/AKT 信号通路基因及蛋白表达水平的比较(,n=12)

表4 各组肺组织PI3K/AKT 信号通路基因及蛋白表达水平的比较(,n=12)

3 讨论

COPD 的发病原因及其致病机制目前还不十分明确，吸烟是目前公认COPD 的最主要病因。烟草燃烧产生的有害颗粒及氧化物质能直接损伤支气管黏膜纤毛系统，引起支气管痉挛，削弱呼吸道的防御能力和自净能力，并且可活化肺组织中炎症细胞，使其释放包括基质金属蛋白酶在内的多种蛋白酶类、大量氧自由基、氧化产物和多种炎症因子。炎症因子可促进肺组织损伤及气道重塑。大量氧自由基和氧化产物使得细胞外基质过多破坏降解，弹性纤维断裂，逐渐破坏形成肺气肿〔7，8〕。上述细胞和炎症因子共同作用导致肺部慢性炎症的产生，最终使肺部结构改变〔9〕。丹参酮ⅡA 磺酸钠具有抗氧化，降低血液黏度以抑制凝血、促进纤溶、抑制血小板聚集、延长血栓形成及促进血栓溶解作用等。近年来关于丹参酮ⅡA 磺酸钠的抗炎特性越来越受到关注，并且在抑制组织重塑、凋亡、血管新生等方面具有一定作用〔10〕。已有关于丹参酮ⅡA 磺酸钠对COPD 治疗作用的研究〔6，11〕，但是对老年COPD 的治疗作用却未见报道。本研究结果显示，丹参酮Ⅱ磺酸钠可显著改善老年COPD 大鼠的呼吸功能。

目前大多认为COPD 为慢性持续性炎症性气道疾病，而巨噬细胞、中性粒细胞、上皮细胞等是COPD 炎症的主要参与细胞。机体发生COPD 时，肺不同部位的肺泡巨噬细胞、T 淋巴细胞和中性粒细胞表达增加，对各级支气管系统的浸润，聚集在支气管周围的炎症细胞被激活释放大量炎症因子〔12〕，对气道结构细胞和促进中性粒细胞炎症反应均产生重要影响。因此，计数BALF 中炎症细胞数量可间接评估COPD 严重程度。本研究结果说明丹参酮Ⅱ磺酸钠对老年COPD 大鼠的治疗作用可能与其降低肺组织炎症细胞有关。

炎症因子在COPD 的炎症反应中发挥重要作用。TNF-α 具有较强的抗病毒、抗肿瘤、免疫调节及炎症诱导作用〔13〕。IL-1β 主要由白细胞特产生，参与机体炎症反应、免疫应答。同时，IL-1β 还可与其他炎性物质相互诱导、共同作用，募集并激活炎性细胞〔14〕，引起其他炎性物质的产生〔15〕。IL-6 主要由单核-巨噬细胞、B 淋巴细胞和T 淋巴细胞、成纤维细胞和内皮细胞等分泌，与多种组织、细胞有亲和力，能够调节免疫应答、参与炎症反应的功能〔16〕。IL-8 主要由单核巨噬细胞产生，可促使中性粒细胞活化和迁移，释放炎症介质，可直接导致组织受到损害〔17〕。IL-18 主要由巨噬细胞分泌，在对病原体天然免疫的防御中起重要作用。IL-18 可诱导中性粒细胞并聚集至气管、支气管及肺组织，并产生氧自由基和水解酶，不断加剧支气管和肺内的炎症作用，最后导致COPD 发生〔18〕。本研究结果显示，丹参酮Ⅱ磺酸钠可剂量依赖性降低老年COPD 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-18 水平，说明丹参酮Ⅱ磺酸钠对老年COPD 大鼠的治疗作用可能与其降低上述炎症因子水平有关。

PI3K/AKT 信号通路是细胞内参与细胞炎症、凋亡和自噬等经典信号通路，参与COPD 的发展。PI3K 是一种可催化磷脂酰肌醇磷酸化的脂类激酶，AKT 是进化上高度保守的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，mTOR 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也是AKT 下游众多的靶因子之一。激活PI3K 后使磷脂酰肌醇磷酸化，募集AKT 和PDK1 丝氨酸/苏氨酸激酶，活化AKT 并激活mTOR，导致内皮细胞增殖和分化，促进上皮细胞间质转化〔19〕。香烟烟雾可诱导PI3K/AKT 磷酸化增加，导致COPD 患者小气道纤维化〔20〕。本研究结果说明丹参酮Ⅱ磺酸钠对老年COPD 大鼠的治疗作用可能与其调节肺组织PI3K/AKT 信号通路基因和蛋白的表达有关。

综上，丹参酮ⅡA 磺酸钠可显著改善老年COPD 大鼠的肺功能，其作用可能与其降低机体炎症反应、调节PI3K/AKT 信号通路基因和蛋白的表达有关。