基于“脾主肌肉”理论探讨Sirt1/Foxa1 通路介导泽明红山颗粒治疗非酒精性脂肪性肝炎的机制

任柏樾 姚辉 卢秉久 （辽宁中医药大学 研究生院,辽宁 沈阳 003; 附属医院传染科）

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是一种受多因素影响的代谢应激性肝病。在祖国医学中属“痞满”“鼓胀”等范畴，饮食不结，过食肥甘厚腻，脾失健运，痰湿蕴结，内生热毒，互结于肝，以致肝失疏泄、木郁壅土，为本病的主要病机，疏肝健脾，清热化湿，祛痰化瘀，滋补肝肾为本病的基本治则〔1〕。目前尚无有关NASH 特异性药物，仍以预防危险因素为主，中医药在治疗NASH 方面比较广泛，主要体现在疏肝调脂，健脾祛湿，抑制氧化应激及肝脏纤维化等多个方面，卢秉久教授行医三十余年，善用自拟的泽明红山茶（泽泻20 g、山楂20 g、决明子20 g、红曲6 g、陈皮10 g、苍术15 g）治疗脂肪代谢紊乱性疾病〔2〕。本研究在泽明红山茶上予以加减，创新药物炮制方法，自拟泽明红山颗粒用于NASH 临床治疗，效果显著，但其作用机制尚不明确。

目前“二次打击”被认为是NASH 的经典作用机制，所谓“初次打击”是指NASH 初期肝功能异常导致脂质代谢紊乱及胰岛素抵抗，机体糖原及脂肪酸异常蓄积，诱导肝细胞脂质变性。随后的“二次打击”即肝细胞的毒性作用，肝细胞经历初次打击后，对氧化应激、炎性介质、线粒体障碍等敏感性增强，进一步诱导肝细胞损伤〔3，4〕。《金匮要略》云:“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”，明确提出肝主疏泄功能与脾主运化之间互相作用机制，这与NASH“二次打击”学说中胰岛素抵抗与线粒体之间作用机制相对应〔3，5〕。本研究提出假说泽明红山颗粒对NASH 的作用机制可能是通过调控胰岛素-线粒体功能来实现的。

转录沉默信息调节因子（Sirt）1 是NAD+依赖的组蛋白脱乙酰酶，是细胞代谢的调节因子之一，Sirt1可以通过调节线粒体的生物发生、葡萄糖和脂质的稳态来控制代谢〔6～8〕。是Foxo1 转录功能的重要调节子，Sirt1 可通过去乙酸化作用调节Foxo1，促进其表达，而Foxo1 能够通过降低氧自由基抑制骨骼肌损伤〔9，10〕。因此，Sirt1 去乙酸化介导的Foxo1 活性改变可能是一种通过调节脂质代谢来对抗NASH 的新机制或药物靶点。本研究旨在基于脾主肌肉理论探讨Sirt1/Foxa1 通路介导泽明红山颗粒治疗NASH的调控机制，为临床防治NASH 提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SPF 级C57BL/6 小鼠40只，体重20～25 g，购自辽宁长生生物科技股份有限公司〔生产许可证SCXK（辽）2018-0001〕，饲养于辽宁中医药大学实验动物中心屏障系统（使用许可证SYXK 辽2013-0009），自由取食水。随机分为对照组（control 组，n=10）、NASH 模型组（NASH 组，n=10）、NASH 模型+泽明红山颗粒组（ZMHS 组，n=10）及多烯磷脂酰胆碱胶囊（易善复，购自赛诺菲制药有限公司，批号H20059010）西药对照组（PPC 组，n=10）。

1.2 NASH 模型制备 采用高脂纯化饲养（MD45%添加0.5%胆固醇）法建立NASH 小鼠模型，control 组给予普通饲料，造模组予以高脂纯化饲料，二者均购于江苏美迪森公司。第4 周末开始，每周末于模型组中随机抽取1 只小鼠，过量麻醉处死，打开腹腔，暴露肝脏，无菌条件下取肝脏做苏木素-伊红（HE）染色切片，直至第8 周末，随机挑选3 只小鼠，行肝组织HE 染色，评价造模情况。ZMHS 组于模型成功后予以泽明红山颗粒（由辽宁中医药大学附属医院提供）灌胃治疗，PPC 组予以易善复治疗，余组予以等量生理盐水，连续干预4 w。PPC 组小鼠给药剂量根据临床成人单日用量最高剂量1.37 g/70 kg，按人与动物体质量系数进行换算后得到为0.18 g/kg；ZMHS 组给药剂量根据成人临床用量按人与动物体质量系数进行换算后得到（6.25 g/kg）。

1.3 样品采集 各组于取材前12 h 禁食水，末次给药后腹腔注射3.5%水合氯醛10 ml/kg 进行麻醉，于腹主动脉收集血液，3 500 r/min、5 min 分离血清，部分于全自动生化仪检测，部分置于液氮中，剥离后腿腓肠肌组织及肝脏，部分置于多聚甲醛中固定，另一部分置于-80℃冰箱保存。

1.4 谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL）水平检测 利用全自动生化分析仪检测各组小鼠血清中ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL 水平。

1.5 HE 染色 取出固定后组织，PBS 冲洗残留液体，经梯度酒精脱水，二甲苯透明，侵蜡包埋，组织切片机切片，厚度4～6 μm，水中烫平，贴片，烤片后，经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，于苏木素染色5 min，1%盐酸酒精分色5 s，氨水冲洗反蓝1 min，蒸馏水冲洗30 s，经伊红染液30 s，PBS 冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明处理，中性树胶封片，光镜下观察组织形态结构。

1.6 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测 ELISA 试剂盒购自武汉优尔生生物科技有限公司，室温下平衡试剂盒，取出酶标板，依次加入50 μl 标准品，设置对照组及样品组，分别加入50 μl 样品及蒸馏水，加入100 μl 酶标记溶液，37℃孵育1 h，充分洗板，各孔加入显色剂A，B 液各50 μl，避光孵育15 min，加入50 μl 终止液，波长450 nm 的酶标仪上读取各孔的吸光度（OD）值，OD 值为纵坐标（Y 轴），标准品的浓度为横坐标（X 轴），绘制标准曲线图。根据样品的OD 值查找对应的浓度范围。

1.7 腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）酶染色 新鲜肌肉组织冷冻切片，pH10.4 的工作液孵育5 min，倾去孵育液，pH9.4 的工作液孵育30 min，倾去孵育液，CaCl2 溶液处理3 次，每次2 min。硝酸钴5 min，PBS 冲洗5 min。1% 硫化铵溶液30 s，PBS 冲洗5 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。

1.8 免疫荧光 切片经脱蜡，水化后，固定10 min，PBS 冲洗3×3 min，加入血清封闭30 min，PBS 冲洗3×3 min，加入一抗，4℃孵育过夜，PBS 冲洗5×5 min，加入二抗，孵育2 h，DAPI 复染，封片，镜下观察。

1.9 Western 印迹 将组织剪碎，加入蛋白酶抑制剂的RIPA（Thermo，89900），匀浆，4℃下12 000 r/min离心5 min，分离上清液，BCA（Thermo，23225）蛋白定量试剂盒进行蛋白液浓度测定，十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）后进行蛋白转膜，加入Sirt1（ab156585）、Foxa1（ab218201）抗体；4℃孵育过夜，PBS 清洗聚偏氟乙烯（PVDF）膜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育2 h后，使用电化学发光（ECL）试剂盒和凝胶成像系统对蛋白进行显色，结果使用Image J 进行分析。

1.10 统计学分析 应用SPSS21.0 软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结果

2.1 各组外周血清中ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL水平 与control 组相比，NASH 组血清中ALT、AST、TC、TG、LDL 表达明显升高，HDL 表达明显降低（P＜0.05），与NASH 组比较，ZMHS 组及PPC 组小鼠ALT、AST、TC、TG、LDL 表达明显下降，HDL 表达明显升高（P＜0.05），与PPC 组比较，ZMHS 组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL 水平表达(,n=10)

表1 各组ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL 水平表达(,n=10)

与control 组比较:1）P＜0.05；与NASH 组比较:2）P＜0.05；下表同

2.2 HE 染色观察肝脏病理形态 如图1 所示，control 组小鼠肝组织结构完整，肝小叶结构正常，中央静脉壁薄，肝细胞呈索条状，呈放射转排列，细胞结构清晰，胞质均匀，核质比例正常。NASH 组小鼠肝组织可见肝小叶结构尚正常，可见重度肝细胞脂肪变性，以弥漫性大泡脂肪变为主；肝细胞体积增大，胞质疏松，边界欠清，呈气球样变；可见程度不等的点状或灶性细胞坏死，肝实质及汇管区单核细胞及淋巴细胞浸润。ZMHS 组及PPC 组可见肝细胞组织形态、结构，与模型组比较明显改善。

图1 HE 染色观察各组肝脏损伤(×200)

2.3 各组小鼠骨骼肌中ATP、磷酸肌酸激酶（CPK）、α-羟丁酸脱氢酶（HBD）、ALT、乳酸脱氢酶（LDH）水平 与control 组比较，NASH 组肌肉中CPK、α-HBD、ALT、LDH 表达明显升高，ATP 表达明显降低（P＜0.05），与NASH 组比较，ZMHS 组及PPC 组CPK、α-HBD、ALT、LDH 表达明显下降，ATP表达明显升高（P＜0.05），与PPC 组比较，ZMHS 组ATP、CPK、α-HBD、ALT、LDH 表达变化无明显差异（P＞0.05）。见表2。

表2 各组ATP、CPK、-HBD、ALT、LDH、Sirt1、Foxa1 蛋白表达(,n=10)

表2 各组ATP、CPK、-HBD、ALT、LDH、Sirt1、Foxa1 蛋白表达(,n=10)

2.4 ATP 酶染色观察骨骼肌损伤情况 Ⅰ型肌纤维为浅色，Ⅱ型肌纤维为深色。control 组可见骨骼肌纤维大小均匀，形态规则，排列成马赛克状，NASH组Ⅱ型纤维染色加深，骨骼肌纤维增粗，出现明显损伤，PPC 组骨骼肌纤维大小明显恢复，形态较为规则，ZMHS 组可见Ⅰ型肌纤维及Ⅱ型肌纤维分布均匀，形态规则，肌纤维损伤基本恢复。见图2。

图2 ATP 酶染色观察各组消失骨骼肌损伤(×200)

2.5 免疫荧光观察过氧化物酶体增殖物活化受体激活因子（PGC-1）、过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPARα）、核呼吸因子（NRF）-1、线粒体转录因子（mtTF）A 表达 与control 组比较，NASH 组血清中PGC-1、PPARα、NRF-1、mtTFA 表达明显降低（P＜0.05），与NASH 组比较，ZMHS 组及PPC 组PGC-1、PPARα、NRF-1、mtTFA 表达明显升高（P＜0.05），与PPC 组比较，ZMHS 组PGC-1、PPARα、NRF-1、mtTFA表达变化无明显差异（P＞0.05）。见图3～6、表3。

图3 免疫荧光观察各组PGC-1 表达(×200)

图4 免疫荧光观察各组PPARα 表达(×200)

图5 免疫荧光观察各组NRF-1 表达(×200)

图6 免疫荧光观察各组mtTFA 表达(×200)

2.6 Western 印迹检测Sirt1、Foxa1 蛋白表达 与control 组比较，NASH 组血清中Foxa1 蛋白表达明显升高，Sirt1 蛋白表达明显降低（P＜0.05），与NASH 组比较，ZMHS 组及PPC 组Foxa1 蛋白表达明显降低，Sirt1 蛋白表达明显升高（P＜0.05），与PPC组比较，ZMHS 组Sirt1、Foxa1 蛋白表达变化无明显差异（P＞0.05）。见表3、图7。

表3 各组PGC-1、PPARα、NRF-1、mtTFA 蛋白阳性表达(,n=10)

表3 各组PGC-1、PPARα、NRF-1、mtTFA 蛋白阳性表达(,n=10)

图7 Western 印迹检测Sirt1、Foxa1 蛋白表达

3 讨论

目前已知脂肪蓄积、胰岛素抵抗诱导炎性反应及氧化应激反应与肝功能异常的相互作用是引起NASH 病理进展的主要原因。因此及时把握NASH病理变化进展对于治疗NASH 具有重要意义〔11，12〕。中医学中将NASH 称“肝癖”，其病位在肝，脾，肾，主要与气、血、津液的生成及运行相关，气滞，血瘀，痰湿为其主要病理产物。肝癖早期，因饮食不结、情志不调、素体肥胖等因素导致肝失疏泄，气机郁滞，内生痰湿，脾失健运，进一步影响气机通畅，早期则以脾虚肝郁为主，两者相互影响，蕴生痰湿，血瘀等病理产物〔13〕。这与NASH 早期胰岛素抵抗，脂质代谢紊乱机理相一致。而病程日久，气血生化乏源，先天无以养后天，后期累积于肾，导致肾精亏虚，肝肾功能异常，进一步接受病理产物损伤，则是NASH 二次打击的病理体现，因此疏肝健脾，活血利水是治疗NASH 早期病理性损伤的主要治则〔14〕。泽明红山颗粒主要由泽泻、山楂、决明子、红曲四味药组成，山楂、红曲两者在肝癖早期共行健脾祛湿，活血化瘀之功效，此外现代医学研究表明，红曲米中有效成分具有降脂、抑炎、保护肝细胞等作用，同时还具有调节血糖代谢，抑制胰岛素抵抗的作用〔15～17〕。泽泻、决明子具有利水祛湿，清肝泻火的功效，同时有研究发现泽泻可以抑制内源性胆固醇合成的作用。上述四味药共奏益气健脾，活血化瘀，利水祛湿的作用，本研究发现泽明红山颗粒可以显著抑制NASH 小鼠外周血清中胆固醇表达，同时改善小鼠肝脏病理损伤，说明泽明红山颗粒对调节NASH 脂质代谢紊乱及胰岛素抵抗具有重要作用。

胰岛素抵抗被认为是NASH 早期病变的核心及启动因素，大量游离脂肪酸蓄积，促进胰岛素抵抗的发生，导致葡萄糖不能对组织细胞摄取及利用，诱导线粒体氧化应激反应发生，ATP 合成减少，是引起靶器官损伤的主要原因〔18〕。骨骼肌细胞是能量代谢的主要部位，在机体能量代谢和维持葡萄糖稳态环境中发挥重要作用，是NASH 主要受损靶器官之一，有研究发现骨骼肌细胞线粒体功能障碍，导致ATP合成/释放异常，胰岛素抵抗发生的潜在重要因素，因此改善骨骼肌细胞损伤有助于提高胰岛素抵抗的敏感性〔19〕。从中医角度血糖、脂肪、蛋白质等就是“精微物质”，水谷精微的转化，依赖于脾主运化功能正常，脾失健运，水谷精微物质堆积在体内，又依赖于胰岛素的调节，当胰岛素抵抗发生时，蓄积在血脉中的精微物质不能被组织有效吸收利用，同时又加重脾的运化功能〔20〕。因此本研究认为脾主运化与胰岛素的调节作用关系密切。本研究发现泽明红山颗粒可以显著改善NASH 小鼠骨骼肌损伤，同时促进ATP 的合成，抑制肝脏胆固醇的合成及骨骼肌细胞中的脂质堆积，提示“脾主肌肉”理论下，健脾对于调节骨骼肌胰岛素抵抗，促进线粒体功能恢复，改善肝功能损伤具有重要意义。

PGC1-α 是细胞内重要的核转录辅助因子，能够促进骨骼肌细胞线粒体的增殖及氧化过程，并刺激线粒体氧化合成ATP，其主要由PPAR 激活，增加脂肪酸氧化酶β 的活性，参与调节脂肪酸氧化及合成平衡〔21〕。NRFs 是由核基因编码的，主要作用于线粒体的呼吸链蛋白，主要与线粒体呼吸及编码线粒体酶有关，有研究发现NRFs 可以促使mtTFA 的表，促进线粒体的活性，提高胰岛素的活性，以促进脂质代谢及葡萄糖代谢过程，共同维持细胞能量代谢稳态，而PGC1-α 是调控NRFs 及mtTFA 的上游，其活性是反映机体线粒体功能及胰岛素的重要因素〔22〕。本研究发现泽明红山颗粒可以显著抑制NASH 小鼠骨骼肌中PGC-1、PPARα、NRF-1、mtTFA 表达，进一步说明泽明红山颗粒可以提高游离脂肪酸的利用度，减轻肝脏负担，增加胰岛素的敏感性，从而改善NASH 小鼠的肝脏及肌肉组织损伤。

Sirt1 是属于Sirtuins 家族的一种组蛋白去乙酰化酶，主要参与调节多种重要的生物学功能，如氧化应激、能量代谢、凋亡和自噬〔23〕。此外，Sirt1 通过去乙酰化调控下游蛋白Foxa1 去乙酰化，参与调控氧化应激的蛋白的表达。PGC-1α 在骨骼肌组织中高度聚集，参与调节下游和线粒体氧化应激相关蛋白的表达，AMPK 可以调节Sirt1 的活性，增加细胞内NAD+，从而激活NAD+依赖的Sirt1 发挥生物学效应〔24〕。激活的AMPK 和Sirt1 调节PGC-1α 的活性，在线粒体生物合成、能量代谢中起着重要的调节作用〔25〕。本研究发现泽明红山颗粒可以显著上调NASH 小鼠骨骼肌中Sirt1 表达，下调Foxa1 表达，这一调控机制进一步提示泽明红山颗粒能够通过调控Sirt1/Foxa1 通路，促进NASH 小鼠骨骼肌细胞线粒体合成，提高骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取及利用，促进游离脂肪酸的糖异生，降低肝细胞的负荷，增加胰岛素敏感性，从而起到保护NASH 小鼠肝脏及骨骼肌组织免于胰岛素抵抗及脂质代谢异常等造成的应激性损伤。