温和灸对小鼠腹腔铜绿假单胞菌生物被膜感染的影响※

景 政,刘晓岚,唐 妮,刘晓庆,荆雪宁,孔晋亮,宋志军,吴 红

(1.山东中医药高等专科学校,山东 烟台 264199;2.广西医科大学第一附属医院,广西 南宁 530021;3.丹麦西南日德兰医院,丹麦 埃斯比约 D K-6700;4.丹麦国家医院,丹麦 哥本哈根 D K-2100)

铜绿假单胞菌是最常见的细菌生物被膜(BF)感染致病菌,也是临床上最常见的条件致病菌之一。临床上铜绿假单胞菌BF相关感染发生率高,而且极难根治。BF是细菌黏附于活性或惰性物体表面形成的高密度细菌团块,并由自身产生的黏性胞外基质包裹着的具有三维立体结构的生物群体[1-2]。大量实验表明,艾灸能抑制炎性反应,促使炎症消散及破损病灶恢复,并且能显著调节机体的免疫功能[2-8]。本实验探讨温和灸在铜绿假单胞菌生物被膜感染的致病性方面的作用,对于临床研究这种难治性院内感染尤其留置导管相关感染的发生、治疗、预防均有重要的指导意义,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8～9周龄清洁级健康雌性昆明(KM)小鼠(18～22g)(由广西医科大学动物实验中心提供,动物合格证号:SC X K桂2014-0002)。

1.2 实验菌株 铜绿假单胞菌PAO1野生型(丹麦哥本哈根大学医院临床微生物科惠赠)。

1.3 BF载体 将一次性使用引流管(苏州鑫达医疗器材有限公司)切割成5mm直径的小圆片,高压灭菌后备用。铜绿假单胞菌在37℃恒温摇床中培养20h,将细菌浓度调整至所需的O D600＝0.05,用24孔板每孔分别加入2.0m L调好的菌液或生理盐水,浸泡一次性引流管圆片,37℃恒温培养20h,取出载体,0.9%氯化钠注射液冲洗两遍备用。

1.4 动物模型的建立 32只雌性KM小鼠饲养标准鼠粮、随意饮水1周。按随机数字表法分为空白对照组、PAO1组、PAO1灸组和空白灸组4组,每组8只。将4组小鼠用4%水合氯醛(0.10m L/10g)腹腔麻醉后,于左侧下腹部局部消毒后切开约8mm切口,逐层分离进入腹腔,将BF载体用0.9%氯化钠注射液轻轻冲洗后放入腹腔,缝合关腹。术后,艾灸组小鼠每日给予腹部温和灸15min,饲养3d后处死小鼠。

1.5 药物和器材 蕲艾条(蕲春药圣草本科技有限公司,长200mm,直径18mm)[9];试剂均为国产分析纯;生物安全柜(苏州净化设备有限公司,BHC-1300 II A/B2);全自动血液分析仪(SY SME X,X T-2000 i),智能生化培养箱(常州市伟嘉仪器制造有限公司,SPX 250)。

1.6 指标检测 小鼠腹腔铜绿假单胞菌生物被膜载体植入3d后取出,采用连续稀释法计算活菌计数;检测小鼠血常规、腹部病理学和细菌学改变(标本选择载体及其周围组织等)。

1.7 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件处理数据,计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

(1)载体活菌计数 PAO1灸组载体活菌计数为(5.24±0.17)CFU/m L,明显少于PAO1组(5.92±0.29)CFU/m L(P＜0.01),空白对照组、空白灸组均未培养出活菌。

(2)血常规结果 PAO1灸组、PAO1组、空白灸组白细胞计数均高于空白对照组(P＜0.05),且PAO1组白细胞计数低于空白灸组(P＜0.05);PAO1灸组、PAO1组单核细胞比值均高于空白对照组(P＜0.05),且PAO1组高于空白灸组(P＜0.05)。见表1。

表1 4组小鼠腹腔植入细菌生物被膜载体后血常规结果比较(±s)

表1 4组小鼠腹腔植入细菌生物被膜载体后血常规结果比较(±s)

注:与空白对照组比较,△P＜0.05;与空白灸组比较,▲P＜0.05。

组别 只数 白细胞计数(109/L) 单核细胞比值(%)PA O 1灸组 8 4.89±0.55△ 8.25±1.37△PA O 1组 8 3.61±0.64△▲ 10.28±2.68△▲空白灸组 8 4.03±0.41△ 3.65±1.49空白对照组 8 2.86±0.80▲ 5.54±1.65

(3)腹腔感染组织病理学改变 空白对照组未见明显炎性反应。与空白对照组比较,PAO1组腹腔载体附近组织炎性反应严重,可见大量中性粒细胞、巨噬细胞等炎细胞浸润;与PAO1组比较,空白灸组组织炎症明显减轻。扫描题目右侧二维码查看图1—4。

3 讨论

铜绿假单胞菌是免疫缺陷患者院内感染和致命感染的常见病原菌之一,可引起慢性感染。随着生物医学材料的广泛使用,相关的临床感染也日益增多,能引起许多慢性感染,如慢性呼吸系统感染、慢性泌尿生殖系统感染、牙周炎及体内留置导管等的感染等。铜绿假单胞菌是常见的BF相关感染病原菌之一。临床抗感染的经验证明,单一抗生素对大多数革兰氏阴性菌,尤其是铜绿假单胞菌的治疗是不理想的,因其会很快出现耐药株,从而导致治疗失败。因此,铜绿假单胞菌慢性感染的研究已成为医学及相关学科等众多领域关注的热点课题。

灸法是利用陈艾叶制成的艾绒柱或艾条,在选定的穴位皮肤表面上点燃或熏灸,借艾火的热力透入肌肤,通过温热刺激产生温经散寒、疏通经络、调和气血的作用,从而达到治病和保健作用的一种疗法。灸法在针灸治疗中属于与针法互补的一种疗法,灸法在现代临床应用广泛,治疗以扶正为主,古有“七年之病,求三年之艾”“陷下则灸之”等描述,“扶助正气”与临床慢性感染治疗多从提高细胞免疫力的思路类似。温和灸通过艾灸的温热作用于穴位,对皮肤的温热刺激可以在局部引起血管扩张,加速血液循环,增强血液代谢,改善局部组织营养,加快组织中异常产物的吸收和清除[1-2]。除了改善血液循环、促进炎症吸收外,温和灸还能促进小动脉及毛细血管周围白细胞移行、浸润,增强吞噬细胞功能,促进抗体形成,增强免疫功能,故对浅层组织的慢性炎症亦有效[3-4]。临床报道中,温和灸在新型冠状病毒、慢性结肠炎及气管哮喘慢性持续期等疾病的治疗中,发挥了独特而有效的作用[6-8]。«本草纲目»记载艾叶:“自成化以来,则以蕲州者为胜,用充方物,天下重之,谓之蕲艾。”蕲艾,性温、苦、辛、微甘,具有镇痛、抗炎、抗氧化等药理作用,其挥发油、总黄酮含量及药理药效均明显优于其他地区所产艾叶[9-10]。本实验以蕲艾艾条为工具[9],根据本课题研究实际需要设计了一种动物用艾灸悬挂装置(专利号:Z L 201920668212.5),艾灸过程中尽可能避免因为灸量及时间差异带来的实验影响,通过实验数据表明,温和灸后小鼠血液白细胞数量明显增多,温和灸治疗对假铜绿单胞菌生物被膜感染引起的腹腔炎症有明显的抑制和治疗作用,对温和灸抑制炎性渗出及促进痊愈可能是通过提高白细胞数量及提高相关免疫机制提供了实验支撑。相关实验研究也表明,针灸可使免疫反应趋于平衡,调节嗜酸粒细胞、巨噬细胞的数量,减少B淋巴细胞分泌免疫球蛋白E等,说明针灸可对相关免疫细胞作用网络进行多靶点和多环节的动态调控,从而发挥抑制慢性炎症的作用[11]。本实验结果也印证了采取温和灸治疗铜绿假单胞菌生物被膜感染有效,从而为临床相关炎症治疗采取温和灸治疗提供理论基础。目前,国内外对此类感染的艾灸治疗研究报道极少。艾灸治疗安全经济、疗效稳定可靠,对临床这种难治性感染的防治指明一个新的方向。