CD8+细胞毒性T淋巴细胞对HBV感染的巨噬细胞的杀伤作用*

程 辉， 臧鲁燕， 孙兆霞， 魏西军， 李冠冲， 李海波

（1齐鲁医药学院人体解剖学教研室，山东淄博255213；2潍坊市人民医院中心实验室，山东潍坊261041）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染全球约2.5 亿人，并增加了发展为肝硬化和肝细胞癌的风险［1］。目前HBV 感染的治疗方法无法从肝脏中完全消除病毒［2］。因此，需要新的治疗方法，包括免疫治疗成分，以实现HBV 的功能性治愈。越来越多的证据表明，受感染的巨噬细胞有助于HBV 的持续存在和发病机制［3］。尽管HBV 感染的CD4+T细胞会在感染后的几天内死亡，但体外研究表明，巨噬细胞对HBV 复制的细胞病变效应具有抵抗力，从而导致病毒持续存在［4］。此外，受感染的巨噬细胞通过逃避中和作用，能在细胞间传播中有效地将病毒传播给CD4+T细胞［5］。CD8+细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T-lymphocytes，CTL）在HBV 感染的急性和慢性阶段控制病毒水平并减少HBV 疾病进展［6］。既往大多数研究都集中在CTL 控制受感染的CD4+T 细胞上，较少关注受感染的巨噬细胞。研究表明，CTL 可以在体外消除 HBV 感染的 CD4+T 细胞［7］。然而，CTL介导的HBV 感染巨噬细胞的杀伤相对效率尚不明确。因此，本研究描述并比较了离体CTL 与HBV感染的巨噬细胞靶标的相互作用，旨在为了解感染HBV的巨噬细胞对CTL的反应提供参考资料。

材料和方法

1 实验材料

小鼠抗CD68 单克隆抗体购自Abcam；兔抗HBV核心蛋白（HBV core protein，HBc）单克隆抗体购自Diagnostic Biosystems；苏木精、Triton X-100、牛血清白蛋白和抗唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素1（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin-1，Siglec-1）抗体购自Sigma；HRP 标记的羊抗兔或鼠免疫球蛋白Ⅱ抗购自DAKO；EasySep Human CD14 Positive Selection Kit II、EasySep Human CD4+T Cell Isolation Kit、EasySep Human CD8+T 细胞分离试剂盒购自STEMCELL Technologies；24 孔或 6 孔低附着板、TC板、L-谷氨酰胺和 HEPES 购自 Corning；重组 GMCSF、重组 M-CSF、抗 CD3 抗体、抗 CD28 抗体、重组IL-15、抗 CD14-APC/Cy7、抗 CD3-APC/Cy7、抗 CD4-APC、抗 TNF-α -BV711、Human TruStainFcX 和 抗CD33-BV421 购 自 BioLegend；IL-2 购 自 R&D Systems；HepAD38 细胞购自 ATCC；DMEM/F12 培养液购自Gaithersburg；HBV 核酸扩增荧光检测试剂盒购自广州中山大学达安基因公司；CellTrace Violet、细胞解离缓冲液、J3-AF647、甲醛PBS、Image-IT FX Signal Enhancer、Zenon Alexa Fluor 488小鼠IgG1标记试剂盒、Hoeschst 和 ProLong Antifade Gold 购自 Thermo Fisher；CytoFix/CytoPerm Fixation/Permeabilization Kit购自 BD Biosciences；抗 HBc-FITC 抗体和抗 HBc 抗体购自Beckman Coulter；抗早期内体抗原1（early endosome antigen 1，EEA1）抗体和抗溶酶体相关膜蛋白1（lysosomal-associated membrane protein 1，LAMP1）抗体购自Cell Signaling Technology；抗兔IgG-AF488购自Jackson ImmunoResearch。

Cx31 显微镜购自 Olympus；ImageStream X Mark II 成像流式细胞仪购自Amnis；LSM 510 共聚焦显微镜购自Carl Zeiss AG。

2 方法

2.1 患者样品收集及免疫组织化学染色 2020 年4 月～2021 年 3 月，收集从健康人群（n=6）和 HBV 感染患者（n=6）中获得的肝脏活检组织。将收集的组织标本立即在液氮中速冻，并保存在-80 ℃下准备用于进一步研究。研究方案经本院伦理委员会批准同意。每位患者均获得书面知情同意书。将组织固定在福尔马林中，包埋在石蜡中，以5 μm 的厚度切片，脱石蜡，再水化。抗原回收，切片在压力锅中于10 mmol/L 柠檬酸盐缓冲液中浸泡3 min。用3%过氧化氢处理3 min 抑制内源性过氧化物酶活性，并用10%非免疫山羊血清阻断非特异性结合位点30 min。用小鼠抗CD68 单克隆抗体（识别巨噬细胞，1∶150）和兔抗HBc 单克隆抗体（识别HBV，1∶200）在4 ℃孵育过夜。次日，采用HRP 标记的羊抗兔或鼠免疫球蛋白Ⅱ抗培养20 min，用DAB基质（DAKO）或永久性红色基质（DAKO）染色，并用苏木精复染。使用Olympus Cx31显微镜对所有载玻片进行检查。

2.2 原代细胞纯化与细胞培养 采用Ficoll 梯度法分离献血者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），并从PBMCs 中分离单核细胞衍生的巨噬细胞和CD4+T 细胞。使用EasySep Human CD14 Positive Selection Kit Ⅱ从冷冻的PBMCs 中分离单核细胞。使用EasySep Human CD4+T Cell Isolation Kit 从剩余的 PBMCs 中富集 CD4+T 细胞。单核细胞接种在24 孔或6 孔低附着板（每孔5×105或2×106个细胞）中，加入含有50 μg/L 重组GMCSF、50 μg/L 重组M-CSF、10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 链霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺和10 mmol/L HEPES 的RPMI-1640培养液，并在7 d内诱导为成熟巨噬细胞。在诱导成熟的第4 天更换一半含有新鲜GM-CSF/M-CSF的RPMI-1640培养液［5-7］。

CD4+T 细胞靶标采用抗CD3 和抗CD28 抗体激活。具体操作为：在分离前1 d，将一块24 孔未处理的TC 板用含2 mg/L 抗CD3 抗体的无菌碳酸氢盐包被 缓 冲 液（8.4 g NaHCO3、3.56 g Na2CO3和 1 L ddH2O，pH 为 9.5，每孔 500 μL）包被过夜。第2 天，每孔用 1 mL 无菌 PBS 洗涤 2 次，加入 400 μL 含有 4 μL 抗 CD28 抗体和 10 μg/L IL-2 的 R10 培养液培养24 h。分离CD4+T 细胞并用含有10 μg/L IL-2的R10培养液重悬至2×109/L，然后将400 μL 细胞悬液加入24 孔板（每孔8×105个细胞），再加入终浓度为2 mg/L的可溶性抗CD28 抗体。激活4～5 d 后，将细胞从板中取出，用R10 培养液洗涤，并以5×108/L 接种在含有 10 μg/L IL-2 的 R10 培养液中，培养 3 d。收获 24孔板中活化的CD4+T 细胞，并接种到T75 烧瓶，加入40 mL含有10 μg/L IL-2的R10培养液。

2.3 细胞培养 HepAD38 细胞用DMEM/F12 培养液（GIBCO/BRL）培养，培养液中含有10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 链霉素和 1 mg/L 多西环素。需要时，去除多西环素以启动HBV 前基因组RNA 转录。细胞在胶原包被的平板上培养。

2.4 HBV 纯化 HBV 从 HepAD38 细胞培养液中浓缩 100 倍，置于含有 10% PEG8000 的 0.4 mol/L NaCl溶液，在4 ℃下放置过夜。以8 000×g离心30 min，取沉淀重悬于无血清DMEM/F12 培养液中。根据HBV核酸扩增荧光检测试剂盒说明书，通过实时聚合酶链反应对上清液中的病毒颗粒进行定量。检测HBV S 区 的 引 物 是 5′-ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT-3′ 和 5′-ACAGGGGGAAAGCCCTACGAA-3′，以 及 5′-FAM-TGGCTAGTTTACAGTGCCATTTGTAMRA-3′荧光探针。在iCycler iQ Real-Time PCR Detection System 中进行了 42个循环的定量 PCR［4］。

2.5 HBV 感染靶细胞的制备 HBV 用于感染GMCSF/M-CSF 衍生的巨噬细胞和CD4+T 细胞，并用于共培养试验。巨噬细胞在37 ℃下与100 ng HBV 在24 孔板中孵育6 h，然后去除病毒。同时，活化的CD4+T 细胞在96 孔平底板中每孔1×106个细胞感染40 ng HBV，在37 ℃下孵育3 h，然后去除病毒［4］。

2.6 CD8+T 细 胞 的 制 备［6］PBMCs（1×106～1.5×106）在共培养实验前置于T75 烧瓶中解冻并接种在含有 50 μg/L 重组 IL-15 的 25 mlL R10 培养液中培养。在确认靶细胞感染后，使用EasySep Human CD8+T细胞分离试剂盒从1.25×107个PBMCs中分离CD8+T 细胞，产率为8%～16%。对于所有共培养测定，效应细胞用CellTrace Violet 染色，以将它们与靶细胞区分开来。将细胞在R10培养液中重悬至约2×109/L，并与CellTrace Viole（t5 mmol/L，重构试剂以1∶2 000 稀释）在37 ℃下孵育5 min，然后将与培养液相等体积的冷FBS 加入细胞中淬灭反应。将细胞沉淀在R10 培养液中洗涤一次，并重悬至合适的浓度以进行测定。

2.7 CTL消除检测 在96孔圆底低附着板中，效应细胞与未感染和感染的靶细胞以不同的效应与靶标比率（effector∶target，E∶T）共培养4 h 或48 h，并将细胞转移到 96 孔 V 型底板，加入 100 μL 细胞解离缓冲液添加到每个样品孔中，并在37 ℃下孵育10 min。在孵育的后半段，将96 孔V 型底板离心以沉淀细胞并吸出培养物上清液。将细胞解离缓冲液推到低附着板孔周围以破坏任何剩余的细胞，然后转移到96孔V 型底板中并与相应的细胞沉淀混合。将细胞离心，吸出上清液，巨噬细胞和CD4+T 细胞用抗CD14-APC/Cy7（用于巨噬细胞）或抗CD3-APC/Cy7（用于CD4+T 细胞）进行表面染色。此外还有抗CD4-APC用于受感染的靶细胞染色。在4 ℃下孵育20 min后，使用BD CytoFix/CytoPerm Fixation/Permeabilization Kit 对样品进行洗涤、固定和透化，并使用抗HBc 抗体进行细胞内染色。使用FACSCanto 流式细胞仪获得流式数据，并使用FlowJo 10.6.0 软件分析所有数据［6］。

2.8 识别检测 在96 孔圆底低附着板中，效应细胞与未感染和感染的靶细胞在E∶T=2 和抗CD107a-AF488 存在下共培养4 h。使用BD CytoFix/CytoPerm Fixation/Permeabilization Kit 对样品进行洗涤、固定和透化，然后使用抗TNF-α-BV711 对细胞进行细胞内染色。使用带有FACSDiva 软件的FACSCanto 流式细胞仪获取流式数据。所有数据均使用FlowJo 10.6.0软件进行分析。

2.9 流式细胞术分析 对于HBV 包膜的内化动力学分析，未感染或HBV 感染的巨噬细胞用细胞解离缓冲液收获，在37 ℃下孵育10 min，计数，然后将约1×105～1.5×105个细胞在 R10 培养液中转移到 4×96孔 V 型底板（0、10、30 和60 min 每个时点一个板）。在加入抗体之前，巨噬细胞样品中加入50 μL FACS缓冲液，然后每个样品中加入5 μL Human TruStain FcX 进行 Fc 封闭。Fc 封闭完成后，将细胞与 1 μmol/L 的 J3-AF647 在 50 μL FACS 缓冲液中反应 30 min，洗涤细胞，并将细胞重悬于50 μL FACS 缓冲液中，立即置于冰上（0 min）或在37 ℃下孵育10、30 或60 min 后转移至冰上。对于每个时点，在冰上放置10 min 后，将抗CD33-BV421 添加到细胞中，在冰上孵育20 min。将细胞洗涤1次，固定并使用BD CytoFix/CytoPerm Fixation/Permeabilization Kit 进行透化，用抗HBc-FITC 对HBc 蛋白进行染色。在ImageStream X Mark II 成像流式细胞仪上从每个样品中收集5 000 个细胞，并使用 IDEAS 6.2 软件（Amnis）进行分析。单染巨噬细胞用于计算补偿矩阵。使用内化向导计算HBc 和HBV 包膜抗体染色的内化分数，使用CD33染色作为表面探针。

2.10 免疫荧光分析 对于含有HBV 包膜的隔室的显微镜分析，在6 孔板中的无菌玻璃盖玻片上操作。巨噬细胞在感染HBV 2～3 d 后，将含有巨噬细胞的盖玻片转移到新的6 孔板中，然后在1 mL R10培养液与200 nmol/L J3-AF647 中孵育1 h，并在室温下固定在4%甲醛PBS（Thermo Scientific）中15 min，用 0.2% Triton X-100 透化 5 min，加入 5 滴 Image-IT FX Signal Enhancer 孵育30 min。然后在室温下加入10%牛血清白蛋白，封闭1 h。巨噬细胞分别与抗EEA1（1∶100）、抗 LAMP1（1∶200）或抗 Siglec-1（1∶100）在3%牛血清白蛋白中孵育1 h，将细胞分别与抗兔 IgG-AF488（1∶250）和抗 HBc（1∶50）孵育 1 h。对于抗Siglec-1 的实验，使用Zenon Alexa Fluor 488小鼠IgG1 标记试剂盒将抗体直接偶联至Alexa Fluor 488，将细胞与抗Siglec-1 和抗HBc 抗体一起作用1 h，然后用 Hoechst 在 PBS 中以 1∶200 稀释度染色 5 min。最后，使用ProLong Antifade Gold 将巨噬细胞置于显微镜载玻片上，边缘用透明指甲油密封并干燥过夜。在Zeiss LSM 510 共聚焦显微镜上获取图像。使用Zen 2009 软件和带有EzColocalization 插件的ImageJ软件进行图像和共定位分析。

3 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0 进行配对或未配对t检验以确定实验条件之间的统计学显著性。每个实验的显著性区间在每个图例中描述。用Pearson 相关分析评估 HBV 包膜与 HBc、EEA1、LAMP1 和 Siglec-1共定位的相关性。数据表示为均数±标准差（mean±SD）。P＜0.05定义为差异有统计学意义。

结 果

1 HBV感染与肝脏巨噬细胞共定位

与健康对照组相比，在来自HBV 感染患者的肝脏样本中观察到HBc 和CD68 的共定位信号（图1），证明肝脏巨噬细胞中存在HBV的蛋白。

2 HBV感染的巨噬细胞抵抗CD8+T细胞杀伤

Figure 1. The HBV protein co-localized with liver macrophages in liver biopsy tissues from HBV-infected patients.Scale bar=50 μm. Brown arrow：HBc；pink arrow：CD68.图1 HBV 感染患者的肝活检组织中HBV 蛋白与肝脏巨噬细胞共定位

将感染HBV 的CD4+T 细胞和巨噬细胞与CD8+T 细胞以 E∶T=2 共培养 4 h，结果显示，消除的感染CD4+T 细胞数量较消除的感染巨噬细胞数量显著增加（P＜0.01），见图2A、B。虽然在48 h共培养后自体CD8+T 对感染巨噬细胞的消除增强，但在多个E∶T比率中，靶细胞杀伤的差异仍然存在（P＜0.05），并随着使用更多效应器而达到同等水平，见图2C。因此，与感染HBV 的CD4+T细胞相比，感染HBV 的巨噬细胞更能抵抗CD8+T细胞的杀伤。

3 CD8+T细胞对HBV感染巨噬细胞的初始反应

CD8+T细胞在与受感染的CD4+T细胞和受感染的巨噬细胞短期共培养4 h 后表现出脱颗粒和TNF-α 产生（P＜0.01），见图3A、B。对受感染巨噬细胞有反应的CD8+T细胞占优势群体表现出缺乏脱颗粒但有很强的TNF-α反应（P＜0.01），见图3C。

4 HBV包膜可瞬时递送到细胞内隔室

通过J3 VHH 染色检测HBV 包膜的表面定位，并在受感染的巨噬细胞表面检测到HBV 包膜，随后在37 ℃下孵育显示HBV 包膜被递送到细胞内隔室中，见图4A。虽然HBc 染色显示内化分数在60 min内没有显著变化，但HBV 包膜在37 ℃下仅在10 min内内化，见图4B。相对于HBV 包膜与HBc 共定位，HBV 包膜与Siglec-1共定位显著降低，但仍显著高于与EEA1或LAMP1共定位（P＜0.01），见图4C、D。

讨 论

巨噬细胞是HBV 感染的目标，HBV 被储存在感染细胞内长寿命的含病毒区室中，在抗病毒疗法期间持续存在于组织中，并在HBV 感染的细胞病变效应中存活下来，以及可以通过细胞间传播促进新的感染［8］。本研究证实了在肝脏巨噬细胞中存在HBV的蛋白。虽然CTL 可以识别这些受感染的目标，但它们的消除效率降低［9］。本研究结果表明，CD8+T细胞在杀死HBV 感染的巨噬细胞方面效率降低。此外，对受感染巨噬细胞有反应的CD8+T 细胞表现出很强的TNF-α 反应，这种机制可能反映了巨噬细胞在初次接触CD8+T细胞时的抗原呈递功能。

Figure 2. HBV-infected macrophages evaded the effective elimination mediated by CD8+ T cells. A：CD4+ T cells and macrophages infected with HBV were co-cultured with CD8+ T cells at different effector∶target（E∶T）ratios for 4 h and 48 h，and then the elimination of HBc+target cells was measured by flow cytometry；B：the summary data of E∶T=2.0 for 4 h；C：the summary data from 48 h co-cultivation with different E∶T ratios. Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CD4+T cells.图2 HBV感染的巨噬细胞逃避CD8+T细胞介导的有效消除

Figure 3. The initial response of CD8+ T cells to HBV-infected macrophages. A：CD8+ T cells were co-cultured with HBV-infected CD4+ T cells or macrophages at E∶T=2.0 for 4 h，and then flow cytometry analysis of CD107a and TNF-α production was performed；B：CD8+ T cell response to uninfected and infected targets（CD107a+TNF-α）；C：comparison of the response of CD8+T cells to infected CD4+T cells and macrophages（CD107a，TNF-α and CD107a+TNF-α）. Mean±SD. n=20.**P＜0.01 vs uninfected；##P＜0.01 vs CD4+T cells.图3 CD8+T细胞对HBV感染巨噬细胞的初始反应

Figure 4. The HBV envelope was delivered instantaneously to the intracellular compartment. A：immunofluorescence staining to detect the kinetics of HBV envelope internalization on infected macrophages；B：internalization score of HBc+envelope+population during 60 min（n=6）；C：representative images of infected macrophages stained for HBc，envelope（J3 VHH）and compartment markers EEA1，LAMP1 or Siglec-1（blue：Hoechst/nuclei；scale bar=10 μm）；D：the correlation coefficient of co-localization of HBV envelope with HBc，EEA1，LAMP1 and Siglec-1（n=50）. Mean±SD.**P＜0.01 vs HBc；##P＜0.01 vs EEA1；△△P＜0.01 vs LAMP1.图4 HBV包膜可被瞬时递送到细胞内隔室

CD8+T 细胞通过多种机制来杀死它们的目标［10］。穿孔素依赖性杀伤迅速，是第一道防线；然而，对于CD8+T 细胞不能立即杀死其靶标或CD8+T细胞进行连续杀伤的情况，杀伤模式可能会切换为通过 Fas 配体参与死亡受体［11］。CD8+T 细胞介导的对受感染巨噬细胞的杀伤需要48 h共培养，而4 h后已检测到对受感染的CD4+T细胞的杀伤。与受感染的巨噬细胞相互作用时，脱粒不良和穿孔素/颗粒酶的释放有限，可能会迫使CD8+T 细胞依赖死亡受体的参与来介导杀伤［12］。在解释2 种不同类型靶细胞的消除测定数据时，还必须考虑细胞大小。巨噬细胞显著大于CD4+T 细胞，但这是否导致需要释放更多穿孔素/颗粒酶才能被杀死尚不清楚［13］。此外，巨噬细胞对CTL 介导的杀伤作用的抵抗力增强可能代表了一种机制，可以通过增加抗原呈递细胞免受哨兵CTL 杀伤的存活率来保持抗原呈递并诱导更有效的适应性免疫反应。此外，CD8+T 细胞对感染巨噬细胞的反应显著偏向于产生TNF-α，而不是CD8+T细胞衍生的溶细胞内容物的释放，表明巨噬细胞杀伤可能是由死亡受体参与介导的，而不是穿孔素/颗粒酶的立即释放。

目前，很少有数据表明HBV 可以被巨噬细胞内化［14-15］。HBV 包膜被认为有助于抑制巨噬细胞反应［16］。在本研究中，对HBV 感染患者的肝活检分析显示HBc 和CD68 之间存在共定位。然而，如何将HBc 递送至巨噬细胞的问题仍有待解决；它可能是通过特定受体或非特异性吞噬。此外，尚不清楚HBc 染色位于哪个亚细胞区室（例如溶酶体等细胞器）。本研究通过细胞内染色HBc 和与驻留蛋白不同的细胞内区室，确定了HBV 包膜被传递到含病毒区室，这与早期内体和溶酶体不同。

总之，本研究结果支持感染HBV 的巨噬细胞抵抗CD8+T 细胞介导的杀伤作用，这可能与二者的相互作用使反应偏向于细胞因子的产生有关，导致低效清除受感染的巨噬细胞。此外，HBV 包膜被传递到细胞内含病毒区室，进一步促进了HBV 感染的巨噬细胞能逃避CD8+T细胞的杀伤作用。这些发现强调了消除受感染的巨噬细胞对HBV 治愈工作的重要性，并且深入理解所观察到的对靶细胞杀伤和导致促炎细胞因子过度分泌的抗性的确切机制，对于开发能够有效消除受感染巨噬细胞和抑制过度炎症的方法是必要的。巨噬细胞杀伤不良的炎症后果也可能对感染巨噬细胞的其他病原体（如结核病、基孔肯雅热和腺病毒）产生影响。