AtNUDX6/7基因缺失型拟南芥基因芯片表达谱的生物信息学分析

尹虹

(南方医科大学基础医学院，广东 广州 510515)

Nudix水解酶(nucleoside diphosphates linked to some moiety X，Nudix)广泛存在于真核生物、古细菌、细菌和病毒中，是一类需要Mg2+的酶，Nudix水解酶拥有一个保守的Nudix基序-GX5EX7REVXEEXGU，其中U通常是Ile，Leu或Val[1-3]。Nudix水解酶根据其水解底物的不同进行分类，其水解底物包含有核苷酸糖，二核苷酸聚磷酸， NADH，ADP-核酸，脱氧核糖核苷酸三磷酸，核糖核苷酸三磷酸等[3]。所以，Nudix水解酶不仅能调节各生化途径的中间代谢产物的积累，还可以清除细胞内产生的有毒代谢产物[4-5]。目前，已发现28个拟南芥Nudix水解酶基因，分别分布于细胞质(AtNUDT1-11、AtNUDT25、AtDCP2)、叶绿体(AtNUDT12-18)和线粒体(AtNUDT19-24、AtNUDT26-27)中[2,6]164-168。Ishikawa等[7]发现拟南芥AtNUDT6基因能通过调节NADH正向调控NPR1依赖的水杨酸信号通路。AtNUDT7基因不仅是EDS1信号通路的负调控因子，同时也是2个不同防御途径的负调节因子，既参与植物细胞程序性死亡，也与保持内稳态的平衡相关[8-10]。以往的研究集中在单个拟南芥Nudix水解酶基因缺失或过表达对植株造成的影响，很少有研究探讨2个或多个以上拟南芥Nudix水解酶基因缺失时的分子机制，因此本研究利用BRB-Array Tools基因芯片数据分析软件对来源于公共基因芯片数据库(gene expression omnibus，GEO)的AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株的基因表达谱芯片数据进行差异表达基因筛选，通过生物信息学分析，从整体上了解其信号通路和基因组的变化，进而了解其分子机制[11-13]。

1 材料和方法

1.1 研究材料

本文所用的数据集来自NCBI里的GEO数据库，这个数据集的序列号为GSE74346。所用芯片都是Affymetrix第1代拟南芥基因组芯片，其中包含22 746个拟南芥基因，实验中，总RNA均来自植株的子叶。GSE74346数据集总共含有8张拟南芥芯片样本，分别为两张哥伦比亚生态型拟南芥植株(野生型，GSM1917702和GSM1917703)，两张AtNUDX6基因缺失型植株(KO-nudx6，GSM1917704和GSM1917705)，两张AtNUDX7基因缺失型植株(KO-nudx7，GSM1917706和 GSM1917707)，以及两张AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株(KO-nudx6/7，GSM1917708和GSM1917709)。

1.2 研究方法

1.2.1 数据过滤和标准化以及差异基因的筛选

从NCBI中的GEO数据库中下载以上 8 个GSM， 解压后放入同一文件夹中。利用BRB-Array Tools Version 3.8.0(http:/ /linus.nei.nih.gov/BRB-ArrayTools.html)软件对芯片数据进行统计学分析，为获得表达信号强且质量高的基因，我们采用中位值的方法对数据进行标准化[11-12]852-855，242-249。对基因过滤时选取基因的标准包括：(1)基因表达数据的缺失数≤50%；(2)基因中位数值至少发生1.5倍的改变，且这种改变≥20%的样本数。对通过过滤标准的基因进行t检验，通过Class comparison对两组样本进行分类比较，找到不同基因缺失型拟南芥植株的差异表达基因(P<0.01)[11]852-855。

1.2.2 不同基因缺失型植株的差异基因分析

利用Venny 2.0在线软件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)对拟南芥不同基因缺失型植株的差异表达基因做交集分析。

1.2.3 AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有差异基因的生物信息学分析

利用Metascape在线工具[9]204-215对AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有差异表达基因进行 GO 本体分析与 KEGG 通路分析，其中P为阈值。GO本体 Cluster 分为分子功能(molecular function，MF)、细胞组分(cellular component，CC)、生物学过程(biological process，BP)[12]242-249。

1.2.4 AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有差异基因的蛋白相互作用网络分析

利用Cytoscape 3.2.1(http://cytoscape.org)中的GENEMANIA软件包[10]1523对AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有差异基因进行蛋白相互作用网络的构建，并利用Cytoscape中的Network Analysis插件对蛋白相互作用网络进行分析，得到网络的相关拓扑系数，如各节点的度(degree)，挑选出在网络中节点(蛋白)度≥10的中心节点，蛋白质相互作用网络的中心节点即是该网络的核心蛋白[14]。本研究中，我们将d≥10的节点定为核心蛋白。

2 结 果

2.1 数据过滤和标准化以及差异表达基因的筛选

通过设定的数据过滤标准及中位值标准化处理后，22 746个探针中有2247个通过了过滤标准，可进行后续的生物信息学分析。应用 BRB-Array Tools 软件在上千种表达差异显著的基因中对两组样本进行了分类比较(P<0.01)，其中，AtNUDX6基因缺失型植株相对于野生型植株共有3个上调基因和3个下调基因。AtNUDX7基因缺失型植株相对于野生型植株共有8个上调基因和13个下调基因。AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株相对于野生型植株共有161个上调基因和152个下调基因，见图1。

A：AtNUDX6基因缺失型；B：AtNUDX7基因缺失型；C：AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型

2.2 不同基因缺失型植株的差异基因分析

应用Venny 2.0在线软件对AtNUDX6基因缺失型植株，AtNUDX7基因缺失型植株以及AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株的差异基因(相对于野生型植株)的韦恩图进行分析，我们发现，基因AT1G26920在3种缺失型的植株中均呈现出高表达，且均在10倍以上。另外，基因AT2G40260和ATNUDT6基因在AtNUDX6基因缺失型植株和AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株中均下调表达；基因AT4G17470、NATA1、ARP9、COR78和AtNUDT7(探针264450_s_at未找到注释基因)在AtNUDX7基因缺失型植株和AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株中均下调表达。AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有的差异基因有304个，其中上调基因160个，下调基因144个，见图2。

图2 3种不同缺失植株的差异表达基因韦恩图

2.3 AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有差异基因的生物信息学分析

Metascape在线分析结果显示AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株差异基因显著参与免疫系统过程、真菌应对反应、缺水应对反应、次级代谢过程、茉莉酸刺激的反应、药物反应、防御反应的调控、活性氧反应、次生代谢物生物合成过程、对光强度的响应等多个生物过程(P<0.01)，见图3。KEGG通路分析发现(P<0.05)，差异基因主要参与植物-病原菌相互作用、α-亚麻酸代谢、苯丙烷类化合物的生物合成以及植物激素信号转导，见图4。Metascape的MCODE插件共寻找到5个密集连接的蛋白质子网络集群motif，见图5。

前20个，P<0.01

图4 AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株差异表达基因生物学过程的 KEGG通路分析

A：PPI网络；B：5种重要motif

2.4 AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有差异基因的蛋白相互作用网络分析

AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有差异基因的蛋白相互作用网络图，见图6，304个差异探针中只有282个差异基因找到，GENEMANIA数据库中找到517对蛋白相互作用对。AHB1、F13K9.15、NF-YC12以及AKT1是节点度10以上的蛋白，在构建的网络中处于中心位置，属于核心蛋白，其中AHB1、F13K9.15和AKT1为3个上调核心蛋白，NF-YC12为下调核心蛋白。图7可以看出AHB1在AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株中表达量最高。

3 讨 论

本研究从GEO数据库中下载了 8个源自拟南芥植株样本的表达谱数据，进行差异表达分析后显示，ATNUDT6基因在AtNUDX6基因缺失型植株和AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株中均下调表达，AtNUDT7在AtNUDX7基因缺失型植株和AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株中均下调表达，说明构建的模型可信度高，可以反应AtNUDX6和AtNUDX7基因缺失后拟南芥植株的基因表达情况。

AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有的差异基因参与植株体内植物防卫反应、次级代谢过程、茉莉酸刺激的反应、损伤反应、真菌应对反应、氧化应激反应、芳香族化合物生物合成过程、活性氧反应等多个生物过程，表明AtNUDX6和AtNUDX7基因能够共同协作参与拟南芥的多种防御反应，并能参与降解细胞的中间代谢物，这与之前的体外研究结果一致[15-16]。

在发现的4个核心蛋白中，AHB1是非共生血红蛋白1，可以被低氧胁迫、蔗糖诱导表达，与氧有很高的亲和性[17-18]。Nudix水解酶可能通过抑制AHB1基因的表达发挥作用。F13K9.15是B-box型锌指蛋白13，目前，对拟南芥B-box型锌指蛋白的研究集中在开花调控、花发育、光形态发生以及光周期调控等方面[19-21]，而在植株防御反应的研究报道较少。AKT1是一个钾离子通道蛋白，对钾的吸收积累有重要作用[22-23]。高表达的AKT1能增加拟南芥的逆境胁迫能力[24]，可能是AtNUDX6和AtNUDX7基因的下游基因。NF-YC12是 NF-Y 转录因子复合物的一个重要组成成分[25]，其详细功能尚未见报道。因此，以上4个核心蛋白在AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型拟南芥中的具体分子作用机制还需进一步验证。

方格代表AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有差异蛋白；黄色方格代表核心蛋白；圆圈代表数据库中与特有差异蛋白相互作用的蛋白

颜色越红，表达越高；颜色越蓝，表达越低