万寿菊发酵提取物对小鼠生长性能的影响和机制研究

柴 燃 ， 秦 鹏 ， 吴 迪 ， 季绍东 ， 薛 强 ， 程鑫颖

（1.晨光生物科技集团股份有限公司，河北邯郸 056250；2.河北工程大学生命科学与食品工程学院邯郸市天然产物与功能性食品开发重点实验室，河北邯郸 056107；3.河北省植物资源综合利用重点实验室（筹），河北邯郸 056107）

现代畜牧业对产量和效率的要求越来越高，通常使用抗生素如土霉素（孙盛明，2020）、杆菌肽锌（Engberg，2000）、金霉素（张憬，2016）等获得高水平产出， 但考虑到其对人类健康和生态环境的影响（包樱钰，2021），全球范围内一直存在监管、限制抗生素在饲料上的使用。 为了在没有药物的情况下保证动物的健康、快速生长，需要高质量的饲料成分和饲料添加剂。 其中，有机酸由于对动物生长效率的积极影响而被广泛使用（潘宝海，2019）。

万寿菊发酵提取物是在提取万寿菊菊花中叶黄素的过程中，通过综合利用得到的，其主要成分为乳酸。 乳酸具有广谱的抑制细菌和抗真菌能力， 常作为添加剂添加到饲料中（Tugnoli，2020）。 因此，为了解万寿菊发酵提取物作为饲料添加剂的功效， 本试验研究了其对小鼠生长性能、胃内容物pH 及肠道微生物的影响，旨在为万寿菊资源的综合利用和万寿菊发酵提取物的进一步应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验所用万寿菊发酵提取物由晨光生物技术集团股份有限公司提供，乳酸（AR级别） 购自天津大茂化学试剂厂，MH 培养基购自青岛海博生物技术公司，盐酸万古霉素、阿莫西林购自上海麦克林生化科技有限公司。 在万寿菊发酵提取物和乳酸中加入二氧化硅制成固态制剂，并使两种制剂的总酸（以乳酸计）含量相当。

1.2 最小抑菌浓度（MIC）试验 96 孔板中每孔加入MH 肉汤培养基100 μL。在第1 列加配好的药液100 μL，然后对药物进行二倍稀释。 即第一孔中加入 100 μL 药液（400 mg/mL）后用移液枪吹打使药物与培养基充分混匀，然后吸取100 μL加入第二孔再充分吹打使之与肉汤充分混匀，照此重复直至最后倒数第二孔，吸出100 μL 扔掉。第12 列作为空白对照组（加菌液不加药液）。再在每一孔中加入稀释好的菌液100 μL。培养箱中培养18 h 后，观察结果。

1.3 试验设计与饲养管理 刚断奶的SPF 级雄性昆明小鼠 （周龄 3 周，19 ～ 21 g）50 只购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，试验动物饲养环境：温度（23±3）℃，湿度 30% ～ 70%，自由饮食饮水，基础日粮组成及营养水平见表1。 小鼠经适应性喂养后，按体重随机对小鼠进行分组，做好标记。 1 组为对照组饲喂基础日粮，试验2、3、4 组分别在基础日粮中添加 2、1.5、1.0 g/kg 的万寿菊发酵提取物， 试验5 组添加1.5 g/kg 乳酸，每组 10 只（分 2 笼），试验周期为 14 d。 鼠笼根据抽签结果随机摆放， 避免生长环境对试验结果造成影响。

表1 基础日粮组成与营养水平（风干基础）

1.4 指标测定及方法

1.4.1 生长性能指标 分别于试验开始喂养的第0、7、14 天空腹称重，按照下列公式计算各生长阶段的平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。

1.4.2 胃内容物pH 称取胃内容物0.2 g， 加入6 mL 纯水，振荡静置10 min 后测上清液pH。

1.4.3 胃蛋白酶活性 取小鼠的胃黏膜组织匀浆上清液样本，利用BCA 法测定其蛋白含量，通过催化血红蛋白分解法测定小鼠胃黏膜胃蛋白酶的活性，按试剂盒说明书进行操作。

1.4.4 胰岛素样生长因子 （IGF-1） 小鼠眼眶取血， 室温静置之后，3000 r/min 离心获得血清，按照说明书测定血清中IGF-1 含量。

1.4.5 肠道菌群测序 每组选取5 只小鼠， 分别取小肠、盲肠、结肠内容物置于试管中，干冰寄送北京诺禾致源科技股份有限公司对16S rDNA 进行测序，比较不同组间的差异。

1.5 数据分析 利用SPSS 21.0 软件对试验数据进行分析，结果以“平均值±标准差”表示，采用one-way ANOVA 比较各组间的统计学差异。

2 结果

2.1 万寿菊发酵提取物对细菌的抑制能力 如表2 所示，万寿菊发酵提取物对金黄色葡萄球菌、福氏志贺菌和沙门氏菌的MIC 和市售产品A 相同，对大肠杆菌的抑制作用稍弱于市售产品A。总体来说，万寿菊发酵提取物与市售产品A 差别不大，具有作为饲料酸化剂的应用潜力。

表2 不同液态有机酸对细菌的最小抑菌浓度 μg/mL

2.2 万寿菊发酵提取物对小鼠生长性能的影响由表3 可知，在试验第一周，与对照组相比，不同试验组的采食量没有明显差别； 万寿菊发酵提取物高剂量组（试验2 组）和乳酸组（试验5 组）的平均日增重较对照组分别提升16.8%、10.8%（P ＜0.05），其余试验组平均日增重都高于对照组但不具有显著性差异（P ＞ 0.05）；试验 5 组 0 ~ 7 d 的料重比与对照组相比，降低10.4%。 试验第二周，试验组的采食量较对照组均降低，其中试验2、4、5 组较对照组分别降低 8.9%、4.0%和9.3%（P ＜0.05）；试验2 组和试验5 组平均日增重较对照组降低18.0%和11.8%（P ＜0.05），试验组料重比较对照组无显著差异（P ＞ 0.05）。

表3 万寿菊发酵提取物对小鼠生长性能的影响

2.3 万寿菊发酵提取物对小鼠胃内容物pH 的影响 由表4 可知， 对照组小鼠的胃内容物pH最高，所有试验组的胃内容物pH 均低于对照组，试验 2、4、5 组的 pH 较 1 组分别降低 1.39、1.19和 1.21（P ＜ 0.05），试验 3 组降低 0.53（P ＞ 0.05）。与对照组相比， 各试验组的小鼠胃蛋白酶活性和IGF-1 含量无显著差异（P ＞ 0.05）。

表4 万寿菊发酵提取物对小鼠胃内容物pH、胃蛋白酶活性和IGF-1 的影响

2.4 万寿菊发酵提取物对小鼠肠道菌群的影响利用16S rDNA 扩增子测序技术对小鼠肠道内容物进行菌群分析，选取试验1 组（对照组）、试验3 组（万寿菊发酵提取物组）和试验5 组（乳酸组）对小鼠不同部位肠道内容物进行测序，确定万寿菊发酵提取物能否通过改变肠道菌群影响小鼠生长性能。 对测序结果进行Anosim 分析表明，万寿菊发酵提取物组、乳酸组与对照组相比，只有小肠菌群的变化具有显著性 （P < 0.05），盲肠和结肠的菌群结构没有明显差异 （P > 0.05）（表 5）。

表5 Anosim 组间差异分析

小鼠肠道菌群中， 在门水平上占据主导地位的菌群是拟杆菌门、厚壁菌门，两者相加能达到肠道细菌丰度的90%以上。 对照组厚壁菌门与拟杆菌门的比值为0.69，乳酸组为1.65，万寿菊发酵提取物中剂量组为1.68， 表明乳酸和万寿菊发酵提取物喂养断奶期小鼠都会增加小肠中厚壁菌门/拟杆菌门的比值（表6）。

表6 不同组小鼠肠道细菌在门水平上的相对丰度

3 讨论

饲料添加剂主要分为酸、益生元、植物产品、益生菌和矿物质等（奚玉莲，2020）。 其中，酸是代替抗生素的最佳选择之一（Liu，2018）。在饲料上，酸最早用作酸化剂和防腐剂， 部分有机酸能参与三羧酸循环，调节微生物菌落构成，意味着有机酸不再被视为饲料的简单酸化剂， 而是生长促进剂和潜在的抗生素替代品（Ferronato，2020）。 乳酸最早从酸奶中分离得到， 具有良好的抗细菌和抗真菌特性。 研究表明，乳酸能参与三羧酸循环，和丙酮酸的作用类似（Rabinowitz，2020）。 乳酸还能促进动物的生长（徐青青，2020；蒋俊劼，2019），广泛作为饲料添加剂使用。在生产叶黄素过程中，采摘的万寿菊花需要用乳酸菌进行青贮 （李大婧，2008）。 为充分开发万寿菊资源，利用万寿菊发酵提取物进行体外抑菌试验和小鼠喂养试验。 MIC试验表明， 万寿菊发酵提取物与市售酸化剂具有相同的抑菌能力。 小鼠试验研究表明， 在喂养第一周， 万寿菊发酵提取物高剂量组和乳酸组的小鼠平均日增重显著高于对照组（P < 0.05），料重比显著低于对照组（P < 0.05），采食量没有显著差异（P > 0.05），说明万寿菊发酵提取物和乳酸能够促进断奶期小鼠的生长；在第二周，高剂量万寿菊发酵提取物和乳酸反而降低小鼠的采食量， 可能是由于降低了饲料的适口性。 根据高剂量组在第一周和第二周结果的不同， 表明要根据动物的生长时期在饲料中添加不同的剂量。

为探究万寿菊发酵提取物和乳酸促进小鼠生长的原因，对小鼠胃内容物的pH、胃黏膜的蛋白酶活性和血清中的IGF-1 进行检测。 结果表明万寿菊发酵提取物和乳酸能够降低小鼠胃内容物的pH， 对黏膜组织中胃蛋白酶活性和血清中的IGF-1 没有影响。刚断奶的幼龄动物，胃部发育不完善（Suiryanrayna，2015），会出现胃酸分泌不足，影响胃蛋白酶的激活， 导致食物消化困难（Ahmed，2014）。 也有证据表明，高 pH 会增加胃排空率，从而减少饲料在胃中的消化时间（Rayner，2012）。本研究表明，在饲料中添加万寿菊发酵提取物能降低小鼠胃内部的pH， 激活胃蛋白酶，促进消化吸收。

肠道菌群是个复杂的生态系统， 也是肠道的重要组成部分，与动物的消化吸收、健康状况关系密切（唐强，2020）。Lee（2018）研究证明，乳酸可通过加速肠道干细胞的分化促进肠道的发育， 本研究表明， 万寿菊发酵提取物和乳酸能够显著改变小肠部位的菌群结构， 增加小肠细菌中厚壁菌门的相对丰度，降低拟杆菌门的相对丰度，对盲肠和结肠菌群结构影响不大。 拟杆菌门及厚壁菌门是肠道内的优势有益菌，Turnbaugh 等（2007）发现，肥胖与拟杆菌门及厚壁菌门相对丰度的改变存在关系，通过与瘦人进行比较，发现胖人肠道中厚壁菌门的相对比例有所增多， 这与小鼠试验结果一致。 能够增加小鼠小肠中厚壁菌门与拟杆菌门细菌比例，促进肠道的消化和能量吸收，也是万寿菊发酵提取物和乳酸能够降低小鼠料重比的原因。

4 结论

万寿菊发酵提取物可作为酸化剂在饲料中添加，可通过抑制有害菌生长，降低胃内容物的pH帮助食物消化，促进肠道发育，调节肠道菌群结构和提高小鼠的生长性能。 万寿菊发酵提取物在动物的不同生长期需要添加不同剂量， 断奶初期需要较高剂量，后期要降低添加量。