HPLC同时测定杞菊地黄丸中7个成分含量△

王小芳，郑倩倩，路丽娟

石家庄市食品药品检验中心，河北 石家庄 050011

杞菊地黄丸出自《麻疹全书》，现收载于《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典）2020 年版（一部），由枸杞子、菊花、熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻8 味中药组成，可用于治疗肝肾不足、阴虚阳浮、头晕耳鸣、羞明流泪、视物昏花症状，临床主要用于治疗干眼症、高血压、高血脂、早期老年黄斑变性、慢性结肠炎、脑震荡后遗症等[1-5]。

中药复方制剂是多成分协同发挥治疗作用，仅检测单一成分不能全面评价其内在质量，多组分评价模式已成为中药质量控制的一种发展趋势。目前，关于杞菊地黄丸的质量标准研究更多的是关于莫诺苷、马钱苷和丹皮酚的含量测定[6-10]，未检索到对其他成分的含量测定和多组分质量控制的文献报道。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）梯度洗脱，选取酒萸肉中莫诺苷、马钱苷，牡丹皮中芍药苷、丹皮酚，菊花中绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸为检测目标成分，对杞菊地黄丸中7 个成分进行同时测定，为全面评价该制剂质量提供参考。

1 材料

1.1 仪器

ARC 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；CPA225D 型电子天平（德国赛多利斯公司）；Elmasonic P 型超声波清洗仪（德国Elma 公司）；DK-98-Ⅱ型水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品芍药苷（批号：110736-201640，纯度：95.2%）、莫诺苷（批号：111998-201602，纯度：96.3%）、马钱苷（批号：111640-201707，纯度：99.2%）、丹皮酚（批号：110708-201407，纯度：100%）、绿原酸（批号：110753-201716，纯度：99.3%）、木犀草苷（批号：111720-201408，纯度：94.9%）、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸（批号：111782-201706，纯度：97.3%）购自中国食品药品检定研究院。

杞菊地黄丸（大蜜丸）购自北京同仁堂科技发展有限公司制药厂（批号分别为16013106、17010779、17010781）、药都制药集团股份有限公司（批号分别为171101、170401）、天津达仁堂京万红药业有限公司（批号：115495）、北京御生堂集团石家庄制药有限公司（批号：17101007）、天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂（批号：5480075）；杞菊地黄丸（水蜜丸）购自太极集团重庆桐君阁药厂有限公司（批号：17110015）、湖北瑞华制药有限责任公司（批号：180110）；甲醇、乙腈、冰醋酸均为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Inertsil ODS-3 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-甲醇（B）-0.2%冰醋酸溶液（C）梯度洗脱（0～10 min，10%～12%A，0～5%B；10～20 min，12%～14%A，5%～10%B；20～30 min，14%～15%A，10%～25%B；30～40 min，15%A，25%～40%B；40～50 min，15%～25%A，40%～45%B）；检测波长，240 nm（0～18.5、21～25 min，莫诺苷、马钱苷、芍药苷）、348 nm（18.5～21.0、25～42 min，绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸）、274 nm（42～60 min，丹皮酚）；流速：0.9 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚、绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸各对照品适量，加70%的甲醇制成质量浓度分别为482.66、501.95、489.33、1038.15、125.83、62.98、233.99 μg·mL-1的对照品储备液，精密量取对照品储备液1 mL 置25 mL 量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，制备成分别含上述成分19.31、20.08、19.57、41.53、5.03、2.52、9.36 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取剪碎的大蜜丸（批号：17010779）约1.2 g，精密称定后置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇25 mL，密塞后称定质量，加热回流1 h，取出，放冷，再称定质量。用70%甲醇补足减失的质量，摇匀后滤过，取续滤液即得供试品溶液[11]。

2.4 阴性样品溶液制备

按照样品处方和工艺，分别制成缺酒萸肉、牡丹皮、菊花的阴性样品，按2.3项下方法制备，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性考察 分别取阴性样品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液，按2.1 项下色谱条件测定（图1）。由图1可知，样品中各测定峰分离良好。缺牡丹皮阴性样品溶液在与芍药苷、丹皮酚色谱峰相对应的保留时间无色谱峰；缺酒萸肉阴性样品溶液在与莫诺苷、马钱苷色谱峰相对应的保留时间无色谱峰；缺菊花阴性样品溶液在绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸色谱峰相对应的保留时间无色谱峰，表明阴性无干扰。

图1 混合对照品溶液、阴性样品溶液及杞菊地黄丸样品高效液相色谱图

2.5.2 线性关系考察 取2.2项下混合对照品储备液适量，分别加70%甲醇稀释100、50、25、10、5、1倍，制得不同质量浓度的混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表1。由表1 可知，莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚、绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸在试验范围内线性关系良好。

表1 杞菊地黄丸中7个化学成分的回归方程及线性范围

2.5.3 精密度试验 取同一批供试品（批号：17010779）按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定6 次，计算莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚、绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰面积的RSD 分别为0.64%、0.80%、0.72%、0.10%、0.71%、1.02%、0.74%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 重复性试验 取同一批供试品（批号：17010779），按2.3 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在2.1项下色谱条件进样测定，计算6份样品的含量，莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚、绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量的RSD分别 为1.08%、1.73%、1.08%、1.63%、1.60%、1.74%、1.14%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 稳定性试验 取同一样品（批号：17010779）按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h 进样测定，测得莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚、绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰面积的RSD分别为1.37%、0.70%、1.05%、0.20%、1.87%、1.15%、1.16%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.6 加样回收率试验 精密称取同一样品（批号：17010779）约0.6 g，共6份，置于具塞锥形瓶中，精密加入混合对照品溶液（莫诺苷48.266 μg·mL-1、马钱苷50.195 μg·mL-1、芍药苷48.933 μg·mL-1、丹皮酚103.815 μg·mL-1、绿原酸12.583 μg·mL-1、木犀草苷6.298 μg·mL-1、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸23.399 μg·mL-1）5 mL，再精密加入70%甲醇20 mL，之后按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率，结果莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚、绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的回收率分别为99.73%、101.00%、98.67%、99.19%、102.56%、101.66%、100.98%，RSD分别为1.29%、0.51%、1.21%、1.01%、0.97%、1.07%、0.47%，结果表明该方法的准确度良好，见表2。

表2 杞菊地黄丸中7个成分含量测定的加样回收率试验

2.5.7 样品含量测定 取不同厂家10 批样品，按2.3 项下方法制备供试品溶液，2.1 项下色谱条件进样测定，计算各成分含量，结果见表3。

表3 不同厂家杞菊地黄丸中7个成分的含量测定（n=2）mg·g-1

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法

本实验对比了不同的提取溶剂（50%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、甲醇）、提取方法（超声提取、加热回流提取）、提取时间（30、45、60、75 min）对杞菊地黄丸中芍药苷、莫诺苷、马钱苷、丹皮酚、绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸7 个成分含量的影响。最终确定制备方法为70%甲醇加热回流提取1 h[11]。

3.2 流动相选择及优化

本实验对比了不同种类的流动相，首先参照《中国药典》2020 年版采用乙腈-磷酸溶液[11]、再采用乙腈-冰醋酸溶液梯度洗脱，结果3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的分离效果不好；后采用甲醇-磷酸溶液、甲醇-冰醋酸溶液，结果木犀草苷分离效果不好且分析时间过长；之后选择了甲醇-乙腈-冰醋酸溶液，并通过优化流动相比例，使各峰有较好的分离度，因此，最终确定以甲醇-乙腈-0.2%冰醋酸为流动相。

本实验采用HPLC 同时测定了杞菊地黄丸中芍药苷、莫诺苷、马钱苷、丹皮酚、绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量，该方法准确度高、重复性好，可为该制剂质量标准的提高提供参考。