不同产区黄芩SSR分子标记鉴别研究△

刘美娟，郑司浩，赵莎，秦义杰，曾燕，王继永

中国中药有限公司，北京 100195

黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi 为唇形科黄芩属多年生草本植物，是一种广泛使用的大宗药材，其以根入药，味苦，性寒，有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效[1-3]。黄芩产于河北、辽宁、吉林、内蒙古、山东、山西、陕西等地，不同产地黄芩药材的药效差异较大[4-5]。近年来，对黄芩的研究多集中在生理生化、药理等方面[6-7]，不同种质鉴别多运用性状鉴别及显微鉴别等方法[8]，通常依赖于个人经验及主观判断，技术可推广性欠缺。黄芩产地的鉴别一直是黄芩物种鉴定的技术难点，也是当前中药资源产业面临的行业难题。

DNA 分子标记技术具有高效、准确、不受环境条件影响、实验操作简单等优点[9]，已广泛应用于植物品种真实性鉴定及纯度检测研究[10-11]。简单重复序列（SSR）标记是近年来发展起来的建立在聚合酶链式反应（PCR）基础上的第二代分子标记。由于SSR 分子标记具有数量丰富、多态性高、遗传共显性、谱带扩增稳定、精度高、检测时间短、技术成熟等特点，已应用于作物遗传学研究[12-13]。文苗苗等[14]对6 个野生或栽培产区共147 份黄芩种质进行遗传多样性分析和评价，分子聚类结果表明，不同产区黄芩种质间存在一定的遗传分化和基因交流，遗传变异主要存在于产区内。张红瑞等[15]利用简单序列重复区间扩增多态性（ISSR）分子标记技术分析得到，黄芩种源间的亲缘关系与地理位置存在一定的联系。本研究基于黄芩全基因组设计SSR 引物，鉴别河北、辽宁、吉林、内蒙古、山东、山西和陕西地区黄芩种质资源，以期为黄芩产区鉴定、资源的保护和开发及分子标记辅助育种等提供参考。

1 材料

黄芩样本分别采于河北，辽宁、吉林（以下简称“东北”），内蒙古，山东，山西、陕西（以下简称“山陕”）地区共计5 个产区的黄芩各12、12、10、11、13 株，所采样品均为当年萌发的鲜叶，样品信息见表1。经中国中药有限公司曾燕副研究员鉴定为黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi。

表1 黄芩样品采集信息

T100 型PCR 仪、GelDocXR+型凝胶成像仪（美国Bio-Rad 公司）；DYY-6D 型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；1-14 型离心机（德国Sartorius 公司）；NanoDrop One 型超微量分光光度计（美国Thermo公司）。

异丙醇（批号：20190605）、无水乙醇（批号：20190507）均购自国药集团化学试剂有限公司；TaqDNA聚合酶（批号：W9205a）、10×TaqBuffer（批号：U8402a）均购自天根生化科技（北京）有限公司。

2 方法

2.1 基因组DNA的提取

黄芩基因组DNA 利用改良的十六烷基三甲基溴化铵法（mCTAB）提取。取黄芩叶片样品100 mg，浸入液氮冷冻研磨至细小的粉末；加入buffer A溶液1.5 mL，反复颠倒混匀，冰浴10 min，10 000×g离心2 min，弃上清液；加入buffer A 溶液1.5 mL，反复颠倒混匀，冰浴10 min，10 000×g离心2 min 后，弃上清液；加入预热的2%CTAB溶液800 μL，沉淀均质悬浮后，65 ℃水浴1.5～2.0 h，其间颠倒均质溶液3～5次；10 000×g室温离心5 min，取DNA上清液至2.0 mL离心管中，加入等体积CI（三氯甲烷-异戊醇24∶1）溶液，颠倒摇床上混合10 min；10 000×g离心5 min，取上清液至新的2.0 mL 离心管中，加入等体积CI溶液，颠倒摇床上混合10 min；10 000×g离心10 min，取上清液至新的1.5 mL 离心管中，加0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混合后置于-20 ℃冰箱保存1 h以上；10 000×g离心2 min，弃上清液，控干液滴，加入RNase溶液（100 mg·L-1）100 μL，37 ℃保存0.5 h；依次加入双蒸水（ddH2O）150 μL、5 mol·L-1NaCl 50 μL和无水乙醇700 μL，充分混合，10 000×g离心3 min，控干液滴，加入70%乙醇600 μL，混合后离心2 min，弃上清液；加入70%乙醇600 μL，混合后离心2 min，弃上清液；加TE 缓冲液100 μL溶解DNA，并根据超微分光光度计测定将样品DNA稀释至50 ng·μL-1，用于后续的PCR扩增。

2.2 SSR引物筛选

基于文献研究筛选SSR 引物[16]：在SSR 核心区侧翼序列中（150 bp 范围），使用primer 3 进行primer 引物设计。引物最佳长度为24 bp；引物最小长度为20 bp；引物最大长度为28 bp；最佳退火温度为58 ℃；最低退火温度为55 ℃；最高退火温度为60 ℃；1 对引物退火温度的最大差值为1 ℃。其他参数采用primer 3 的默认参数。将得到的引物BLAST 比对回基因组上，将成对引物在基因组上可以扩增得到的序列长度进行比较，与含有目标SSR的产物长度差在2 kb 以上，保留该对引物，与含SSR 产物长度差在2 kb 以内的，滤掉该引物，最终得到59 233对SSR引物。选择重复单元碱基数2～5 bp，重复单元5～10次的50对SSR引物进行预实验，所选择的引物长度为20～25 bp，理论退火温度为55～60 ℃，PCR产物长度为150～350 bp。

2.3 PCR扩增及检验

用筛选出的引物对提取的5 个不同产区所有黄芩DNA 样本进行PCR 反应。反应体系为ddH2O 11.8 μL、10×TaqBuffer 2 μL、2 mmol·L-1脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）2 μL、5 μmol·L-1正向引物（forward primer）1 μL、5 μmol·L-1反 向 引 物（reverse primer）1 μL、TaqDNA 聚合酶（TaqDNA polymerase）0.2 μL、50 ng·μL-1的DNA 模板2 μL。反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性0.5 min，退火0.5 min（引物Sb2、Sb5、Sb13、Sb21、Sb23、Sb26、Sb28 退火温度为55 ℃，引物Sb16、Sb22退火温度为54 ℃），72 ℃延伸1 min，32 个循环；72 ℃延伸10 min。

分别取PCR 扩增产物2 μL，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，电压160 V，时间15 min，通过凝胶成像系统观察否有条带且片段大小是否合适以确认实验成功。将检验成功的PCR 扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行毛细管电泳测序分型，得到PCR扩增产物的分型结果。

2.4 数据分析

PCR 扩增产物分型结果用GeneMarker 4.0 进行峰图判读[17]。记录等位基因片段大小，得到等位基因矩阵，具体是以“0，1”二元方式来记录等位基因片段大小，即某个等位基因存在时记为1，某个等位基因不存在时记0，缺失数据记为-9，从而得到等位基因矩阵。根据上述等位基因矩阵，通过GenALEx 计算黄芩在每个产区间、每个个体间的遗传多样性数据及遗传距离。基于GenALEx 计算所得的个体遗传距离矩阵，通过分子进化遗传分析（MEGA）进行非加权组平均法（UPGMA）聚类分析，构建聚类树。

3 结果与分析

3.1 引物筛选

SSR 是共显性标记，同一引物扩增不同产区黄芩，扩增产物牵引率相同的条带被认为是有同源性[18]。从扩增成功率以及多态性（毛细管荧光电泳方式）2个维度进行引物的选择，最终选定9对多态性好、扩增成功率高的SSR 引物。筛选引物信息见表2，其中Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26 引物对东北地区黄芩扩增成功率高；Sb21、Sb22、Sb28 引物对内蒙古地区黄芩扩增成功率高；Sb5、Sb13、Sb16、Sb22引物对山陕地区黄芩扩增成功率高。

表2 黄芩DNA样品PCR扩增筛选引物信息

3.2 不同产区黄芩遗传多样性分析

3.2.1 基于引物Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26 的遗传多样性分析 多态性位点是衡量遗传多样性的重要参数。基于黄芩SSR 引物组合（Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26）对5 个产区黄芩遗传多样性进行分析，见表3。结果显示，5 个产区黄芩样品的观测等位基因数（Na）为3.200～4.600，有效等位基因数（Ne）为2.704～3.189，Shannon′s 指数（I）普遍较高，为0.994～1.197，其中东北产区的Ne均值相对最低，相应的I也较低。同时山陕产区的样品观测杂合度（Ho）<期望杂合度（He），表明该产区可能存在一定的近交现象或者有杂合缺失未检测到的情况。

表3 基于引物Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26的黄芩遗传多样性分析

3.2.2 基于引物Sb21、Sb22、Sb28的遗传多样性分析 基于黄芩SSR 引物组合（Sb21、Sb22、Sb28）对5 个产区黄芩遗传多样性进行分析，见表4。5 个产区黄芩样品的Ne为1.592～4.091，I除了内蒙古产区外普遍较高，为0.545～1.461，其中内蒙古产区的Ne均值最低，相应的I也较低。河北、内蒙古、山东产区样品的Ho>He，表明该产区可能存在一定的杂种选择现象或者远交现象；东北产区与山陕产区样品的Ho

表4 基于引物Sb21、Sb22、Sb28的黄芩遗传多样性分析

3.2.3 基于引物Sb5、Sb13、Sb16、Sb22 的遗传多样性分析 基于黄芩SSR 引物组合（Sb5、Sb13、Sb16、Sb22）对5 个产区黄芩遗传多样性进行分析，见表5。5个产区黄芩样品的Ne为2.809～4.209，I普遍较高，为1.127～1.537，其中山陕产区的黄芩样品Ne均值最低，相应的I也较低。河北产区的样品Ho

表5 基于引物Sb5、Sb13、Sb16、Sb22的黄芩遗传多样性分析

3.3 聚类结果分析

3.3.1 东北产区黄芩鉴定 基于黄芩SSR引物组合（Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26），通过GenALEx计算各产区黄芩样品的遗传距离（表6）。各产区样品间平均遗传距离为0.296，其中东北与山东产区样品的遗传距离最大，为0.497，说明2 个产区黄芩种群关系最远；山东与河北产区样品的遗传距离最小，为0.192，说明2 个产区黄芩种群关系最近。通过MEGA进行UPGMA聚类分析，构建聚类树（图1）。黄芩样品聚为5 个分支，只有东北产区的聚为较纯的1 个分支，其他分支都有不同程度的混杂情况，同时也说明5 对SSR 引物可以较好地对产地为辽宁和吉林的黄芩样品进行区分鉴定。

表6 基于引物Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26的各产区黄芩样品遗传距离

图1 基于引物Sb2、Sb16、Sb22、Sb23、Sb26的不同产区黄芩遗传聚类

3.3.2 内蒙古产区黄芩鉴定 基于黄芩SSR引物组合（Sb21、Sb22、Sb28），通过GenALEx 计算各产区黄芩样品的遗传距离（表7）。各产区样品间平均遗传距离为0.255，其中山陕与内蒙古产区样品的遗传距离最大，为0.412，说明2 个产区黄芩的种群关系最远；山东与河北、山陕产区样品的遗传距离相对最小，分别为0.099、0.083，说明山东与河北、山陕产区黄芩种群关系相对更近。通过MEGA进行UPGMA 聚类分析，构建聚类树（图2）。只有内蒙古产区的黄芩样品聚为较纯的1 支，其他分支都有不同程度的混杂情况，同时也说明3 对SSR 引物可以较好地对产地为内蒙古的黄芩进行区分鉴定。

表7 基于引物Sb21、Sb22、Sb28的各产区黄芩样品遗传距离

3.3.3 山陕产区黄芩鉴定 基于黄芩SSR引物组合（Sb5、Sb13、Sb16、Sb22），通过GenALEx 计算各产区黄芩样品的遗传距离（表8）。各产区样品间平均遗传距离为0.356，其中山陕与东北产区样品的遗传距离最大，为0.565，说明2 个产区黄芩的种群关系最远；产区河北与产区内蒙古、东北的遗传距离相对最小，分别为0.109、0.196，说明产区河北与产区东北、内蒙古的种群关系相对更近。基于GenALEx 计算所得的遗传多样性数据中的遗传距离，通过MEGA 进行UPGMA 聚类分析，构建聚类树，如图3 所示。只有山陕产区的聚为较纯的一支，其他分支都有不同程度的混杂情况，同时也说明4对SSR 引物可以较好地对山西、陕西产区的黄芩进行区分鉴定。根据4对SSR引物多态位点结果，基于遗传距离，若待鉴别黄芩与山陕产区聚在一起则表示该黄芩产地为山西或陕西。

表8 基于引物Sb5、Sb13、Sb16、Sb22的各产区黄芩样品遗传距离

图3 基于引物Sb5、Sb13、Sb16、Sb22的不同产区黄芩遗传聚类

4 讨论

SSR 分子标记在亲缘关系鉴定、遗传进化关系、指纹图谱、育种等领域应用十分广泛[19-23]。因此，可以利用分子标记方法区分不同产区黄芩资源，并鉴定黄芩亲缘关系。本研究利用SSR分子标记的方法，筛选出9 对引物，针对河北、东北（辽宁、吉林）、内蒙古、山东、山陕（山西和陕西）地区共计5 个产区的黄芩进行遗传多样性分析。结果表明，不同产地的黄芩具有丰富的遗传多样性，这与齐琳洁等[24]研究结果一致，为黄芩种质资源评价与利用提供了依据。张红瑞等[15]采用ISSR 分子标记对54个黄芩种源进行分析。聚类分析图自然聚为3 类，且地域相近的种源首先聚为一类，也存在陕西佳县种源和辽宁建昌种源聚为一类，但不同的标记得到的结果可能有差异。本研究对不同产区黄芩进行SSR 分子标记鉴别，得到3 个引物组合用于鉴别东北、内蒙古、山陕产区的黄芩。而河北和山东产区的黄芩种质由于混杂较为严重，目前无法根据产地将其区分开，这一研究结果与文苗苗等[14]的研究结果一致。本研究结果可为黄芩优势种植资源收集、保存与评价提供参考。