胆类中药体内代谢产物甘氨胆酸硫酸盐同分异构体的区分△

张珂，李玮，王艳敏，龚兴成，曹丽波，宋月林，宋青青，屠鹏飞

北京中医药大学 中药学院 中药现代研究中心，北京 100029

胆类中药（如熊胆、蛇胆、牛黄等）多为名贵中药，具有清肝明目、利胆通肠、解毒消肿之功效，常用于胆结石等的临床治疗，疗效确切[1-3]。胆汁酸为胆类中药的主要药效成分。作为重要的结合型胆汁酸，甘氨胆酸在胆类中药中广泛分布，且同分异构体较多，如甘氨熊去氧胆酸（GUDCA）、甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA）、甘氨去氧胆酸（GDCA）等。甘氨胆酸硫酸盐为甘氨胆酸体内主要代谢产物类型，也广泛存在同分异构体。研究表明，体内胆酸硫酸盐是胆汁淤积的潜在病理标志物群[4]，胆汁淤积属于中医理论的黄疸范畴。因此，准确鉴定甘氨胆酸硫酸盐化学结构不仅有利于胆类中药体内药效物质的阐明，也有助于黄疸的病理进程及药物治疗效果的精确评估。胆汁酸类成分同分异构体的高分辨多级质谱图几乎一致，常规液相色谱-质谱法（LC-MS）也难以实现这些同分异构体的有效区分。本课题组前期通过构建在线能量分辨质谱法（Online ERMS），采集某个离子对在不同碰撞能量下的响应值，进一步拟合裂解曲线（breakdown graph），获得相应的最佳碰撞能（OCE），实现了部分同分异构体的区分[5-8]。然而，仅通过单一离子对的OCE 值区分同分异构体过于片面，无法提供各同分异构体碎片离子的整体情况。因此，本研究以甘氨熊去氧胆酸-3-磺酸盐（GUDCA-3-S）、甘氨鹅去氧胆酸-3-磺酸盐（GCDCA-3-S）、甘氨去氧胆酸-3-磺酸盐（GDCA-3-S）为研究对象，利用Online ER-MS 策略研究MS2图谱中主要离子（包括母离子）的丰度随碰撞能升高的变化趋势，构建裂解曲线组（breakdown graph set），全面深入分析甘氨胆酸硫酸盐同分异构体多级质谱行为的差异，以期为胆类中药体内代谢产物的准确阐明提供科学依据，同时也为基于LC-MS 的同分异构体快速区分提供有效的方法。

1 材料

1.1 试药

对 照 品GUDCA-3-S（批 号：IR-15693）、GCDCA-3-S（批号：IR-15685）及GDCA-3-S（批号：IR-15689）均购自上海甄准生物科技有限公司，以上对照品纯度经高效液相色谱法（HPLC）检测均大于98%；质谱级乙腈、甲酸和甲酸铵均购自美国Thermo-Fisher 公司；二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma 公司；水为实验室自制Milli-Q 超纯水（18.2 MΩ‧cm）。

1.2 仪器

LC-20AD 型分析型高效液相色谱仪（包括二元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱及控制器，日本岛津公司）；ACQUITY UPLC HSS T3型色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国Waters公司）；Tripe TOF 6600+型高分辨质谱仪和Qtrap 5500型质谱仪（美国Sciex 公司）；Milli-Q 型超纯水净化系统（美国Millipore 公司）；ME204 型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精确度为0.1 mg）。

2 方法

2.1 对照品溶液的配制

精密称取对照品GUDCA-3-S、GCDCA-3-S 及GDCA-3-S 适量，分别溶于DMSO 中，配制成质量浓度为1 mg·mL-1的对照品储备液。吸取各对照品储备液适量，用50%乙腈水溶液稀释成50 μg·mL-1的混合对照品溶液，待用。

2.2 色谱条件

采用Acquity UPLC HSS T3 色谱柱（100 mm ×2.1 mm，1.8 μm），流动相A 为含0.05%甲酸的甲酸铵水溶液（5×10-3mol·L-1），流动相B 为含0.1%甲酸的乙腈，以34%B 等度洗脱10 min；柱温为35 ℃；流速为0.25 mL·min-1；进样量为2 μL。

2.3 质谱条件

Tripe TOF 6600+和Qtrap 5500型质谱仪，均配备电喷雾离子源（ESI）；气帘气（curtain gas，CUR）压力为35 psi（1 psi≈6.895 kPa）；雾化气（nebulizer gas，GS1）压力为55 psi；辅助气（auxiliary gas，GS2）压力为55 psi；喷雾电压（ionspray voltage，IS）为-4500 V；离子化温度为550 ℃。Tripe TOF 6600+实时动态背景扣除（DBS）触发IDA（information-dependent acquisition）模式采集二级图谱，MS1及MS2采集范围均为m/z50～700；碰撞能量（CE）为-35 eV；碰撞能量扩展值（CES）为-25 eV；Qtrap 5500 采用多反应监测（MRM）模式采集数据。

2.4 在线能量分辨质谱

基于GUDCA-3-S、GCDCA-3-S 及GDCA-3-S 的MS1及MS2高分辨信息，构建7对候选离子对，分别为m/z528.3→528.3、528.3→448.3、528.3→404.3、528.3→386.3、528.3→330.2、528.3→97.0，528.3→74.0，进一步衍生出7 组拟离子对（PITs），分别为m/z528.300→528.302、528.300→528.301、528.300→528.301 等；m/z528.300→448.300、528.300→448.301、528.300→448.302等；m/z528.300→404.300、528.300→404.301、528.300→404.302 等 ；m/z528.300→386.300、528.300→386.301、528.300→386.302 等；m/z528.300→330.200、528.300→330.201、528.300→330.202 等；m/z528.300→97.000、528.300→97.001、528.300→97.002 等 ；m/z528.300→74.000、528.300→74.001、528.300→74.002 等。每组拟离子对分别以1 eV步长采集CE为-5～-180 eV的质谱响应。将不同CE 值下的质谱响应导入GraphPad Prism 7.0 软件中，通过Gaussian 曲线拟合各离子对的裂解曲线，形成裂解曲线组，而各拟合曲线顶点对应的碰撞能为OCE值。

3 结果

3.1 甘氨胆酸硫酸盐的质谱裂解途径

负离子模式下，GUDCA-3-S、GCDCA-3-S 和GDCA-3-S 的MS1图谱显示准分子离子峰均为[MH]-，分别为m/z528.262 0、528.263 9和528.262 7。以GUDCA-3-S 为例，归属其二级碎片离子（图1）。MS2图谱中基峰离子信号为m/z448.308 6 [M-HSO3]-，表明母离子经S-O 键断裂中性丢失SO3，进一步中性丢失CO2和H2O，分别产生碎片离子m/z404.313 5[M-H-SO3-CO2]-和386.306 8[M-HSO3-CO2-H2O]-。碎片离子m/z74.025 2（NH2CH2COO-）和96.960 3（HSO4-）分别为结合型胆酸侧链的甘氨酸基团以及磺酸基团断裂产生的特征碎片。结合MS2碎片离子信息和文献数据[4,9-10]，推测GUDCA-3-S、GCDCA-3-S和GDCA-3-S的质谱裂解途径见图2。由于胆汁酸母核结构中7位羟基相比12 位羟基更容易发生脱水[9]，在GDCA-3-S 未见碎片离子m/z386.3。

图1 GUDCA-3-S的二级质谱图

图2 GUDCA-3-S、GCDCA-3-S和GDCA-3-S可能的质谱裂解途径

3.2 在线能量分辨质谱分析

基于高分辨质谱提供的前体离子和碎片离子信息，构建了m/z528.3→528.3、528.3→448.3、528.3→404.3、528.3→386.3、528.3→330.2、528.3→97.0、528.3→74.0 7 对离子对。其中，GCDCA-3-S未检出m/z528.3→404.3，GDCA-3-S未检出m/z528.3→386.6，m/z528.3→330.2 仅在GCDCA-3-S 中检出，但3 对离子对响应过低，不宜选作特征碎片区分同分异构体。

为了进一步探究离子的稳定性及不同化学键解离的能量关系，考察了目标化合物所有离子对在不同碰撞能下的质谱响应，通过Online ER-MS 采集7 对离子对在不同CE（-5～-180 eV）下的响应值，使用GraphPad Prism 7.0 软件分别拟合3 个同分异构体各离子对的裂解曲线。其中，离子对m/z528.3→528.3的裂解曲线如图3所示，GUDCA-3-S、GCDCA-3-S 和GDCA-3-S的裂解曲线 从-5 eV 起始，响应值随CE 增大而增高，在-18～-19 eV 响应达到峰值，但差异并不明显（GUDCA-3-S、GCDCA-3-S和GDCA-3-S峰值的CE分别为-18.48、-18.08、-18.39 eV）。在-19 eV 后响应值随CE值增大而逐渐降低，在-70 eV 附近前体离子m/z528.3 全部解离。这与前期研究发现的离子对（前体离子m/z值与碎片离子相同）的“S”形裂解曲线不同[11]，推测与胆酸类成分结构密切相关，胆酸类为甾体类化合物，具有4个紧密连接的脂环构成的刚性疏水骨架，且有不同数量的-OH、-CH3和-COOH取代基侧链，胆酸离子通过疏水作用和氢键会形成聚集离子，聚集离子与单体离子处于动态平衡[12]。因此，胆酸类化合物离子化时可能会产生[M-H]-、[2M-2H]2-、[3M-3H]3-等前体离子同时通过Q1，随着CE的增加，[2M-2H]2-、[3M-3H]3-等前体离子需克服分子间作用力产生[M-H]-碎片离子，通过Q3 进入检测器；之后随着CE 的不断增加，[MH]-离子解离速率大于其生成速率，于是其响应值逐渐下降。

图3 GUDCA-3-S、GCDCA-3-S和GDCA-3-S的离子对m/z 528.3→528.3的裂解曲线

其余各离子对裂解曲线均呈高斯曲线（图4），计算所得的裂解曲线方程和OCE 值见表1。GUDCA-3-S、GCDCA-3-S 和GDCA-3-S 结构十分相似，仅有1 个羟基取代位点和构象存在差异，不同离子对OCE 差值仅在1 eV 左右。因此，进一步对比离子对在碰撞能为-5～-180 eV 的质谱响应比值（图5）。3 个同分异构体中离子对m/z528.3→528.3与m/z528.3→448.3 的质谱响应比值在-30 eV 时差异较大，GUDCA-3-S 比值为4.83，GCDCA-3-S 为3.87，GDCA-3-S 为4.08；离子对m/z528.3→97.0与m/z528.3→74.0 在-100 eV 碰撞能下的响应比值有明显差异，分别为2.38、2.76 和3.02，可为同分异构体的区分提供参考。

表1 GUDCA-3-S、GCDCA-3-S和GDCA-3-S中各离子对的拟合曲线方程和最佳碰撞能

图4 GUDCA-3-S、GCDCA-3-S和GDCA-3-S的裂解曲线

图5 GUDCA-3-S（tR=2.4 min）、GCDCA-3-S（tR=5.7 min）和GDCA-3-S（tR=6.5 min）的质谱响应比值

4 讨论

质谱法可提供化合物多级质谱信息用于结构解析，但无法对具有相似质谱行为的同分异构体进行准确鉴定。本课题组前期建立的Online ERMS 通过改变碰撞能量，依据目标离子对OCE 与断裂相关化学键的键长、键能关系实现同分异构体的区分。相较于传统能量分辨质谱法[13]，将针泵注射对照品方式转换为与HPLC 联用，一方面实现了进样的自动化和高通量，另一方面可以实现不依赖对照品的离子对质谱响应值的获取，更适用于复杂基质中同分异构体的区分鉴定。随着对Online ER-MS 应用的扩大及对能量和离子对响应关系的进一步理解，发现分析不同碰撞能下所有子离子质谱响应差异更有利于同分异构体的区分。本研究通过建立主要碎片离子随碰撞能变化的趋势图，即建立了X轴、Y轴、Z轴分别为m/z、离子丰度、碰撞能的三维二级质谱图（3D MS2spectrum）。通过三维二级质谱图，可以获得化合物在任何CE值的二级质谱图，为构建化合物全息质谱数据库提供思路[14]。通过分析大量已知化合物，获得目标离子对的最佳碰撞能，结合量子化学计算，构建定量结构-最佳碰撞能关系模型，可以实现基于LC-MS 的化学结构精准鉴定。

本研究采用HPLC-MS采集GUDCA-3-S、GCDCA-3-S和GDCA-3-S 的MS1和MS2离子信息，构建离子对，基于Online ER-MS 策略，全面构建各离子对的裂解曲线。研究发现，离子对m/z528.3→528.3（Q1=Q3）响应随CE 值增大先升高后下降（-18～-19 eV 碰撞能范围内达峰值），推测是由于胆酸类化合物为四环甾体类化合物，分子间的范德华力易导致多分子离子的产生，需要较高的能量破坏[2M-2H]2-、[3M-3H]3-等前体离子间作用力，进而会生成2 倍或者3 倍数量的[M-H]-。进一步分析-5～-180 eV 碰撞能范围内各离子对丰度比值，发现离子对m/z528.3→528.3 与m/z528.3→448.3、m/z528.3→97.0与m/z528.3→74.0 的质谱响应比值的差异可为同分异构体的区分提供参考。本研究通过深入比较GUDCA-3-S、GCDCA-3-S 和GDCA-3-S在不同碰撞能下的质谱行为，建立裂解曲线组，实现了甘氨胆酸硫酸盐同分异构体的区分，为准确阐明胆类中药体内代谢产物及进一步揭示其在体内的药效物质和作用机制提供参考。