藤黄茎皮中莽吉柿素对人胃癌HGC-27细胞的作用研究△

常安琪，张云封，李军，付冬君，宋月林

北京中医药大学 中药学院 中药现代研究中心，北京 100020

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人民的健康，2015 年我国胃癌发病率和病死率分别为0.029%和0.021%，病死率较高[1-2]。近年来，许多研究发现中药具有一定的抗肿瘤作用，并且在中西医结合治疗肿瘤方面显示出增效减毒的作用[3-4]。藤黄是藤黄科藤黄属植物藤黄树的树脂，具有消肿攻毒、祛腐敛疮之功效，现代药理研究认为其具有抗肿瘤的功效[5-7]。莽吉柿素来源于藤黄树的茎皮，研究表明其具有广泛的抗肿瘤药理活性，可有效抑制膀胱癌、人胶质瘤等疾病[8-9]，并可通过抑制神经前体细胞表达的发育下调蛋白8活化酶（NAE）复合物的调节亚基活性，从而抑制相关蛋白的Neddylation 修饰，发挥抑制前列腺癌细胞增殖的作用[10]。Luo 等[9]发现莽吉柿素处理人胶质瘤T98G 细胞后，其基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9 的分泌和活性被显著抑制，推测是由于莽吉柿素对T98G 细胞中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的调控作用所致。目前，莽吉柿素对于胃癌细胞的体内、外作用效果及机制尚不完全明确，因此，本研究采用噻唑蓝（MTT）染色法、克隆形成实验、Hoechst 染色实验、蛋白免疫印迹法（Western blot）、裸鼠移植瘤等技术，探究莽吉柿素对人胃癌HGC-27 细胞和人胃癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响及作用机制，为莽吉柿素临床用药及莽吉柿素抗肿瘤作用机制的深入研究提供参考。

1 材料

1.1 细胞与实验动物

HGC-27细胞购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心；雄性BALB/c 裸鼠，4～5 周龄，购自北京维通利华公司，实验动物许可证号：SCXK（京）2016-0011。实验经北京中医药大学医学与实验动物临床委员会批准（批准编号：BUCM-4-2019120304-4109）。

1.2 试药

莽吉柿素（批号：PRF10102823，纯度≥98%，成都普瑞法科技开发有限公司）；5-氟尿嘧啶（5-FU，批号：B25419，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；RPMI 1640 基础培养基（批号：10-040-CVR）、青霉素-链霉素混合液（批号：30-002-CI）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA，批号：25-053-CI）均购于美国Corning 公司；胎牛血清（FBS，批号：04-001-1A，以色列BI 公司）；MTT 细胞增殖和毒性检测试剂盒（批号：0793，美国Amresco公司）；放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液（批号：G2002）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂盒（批号：G2003）、ECL 发光液（批号：G2014）、肌动蛋白（β-actin）抗体（批号：GB12001）、Ki67 抗体（批号：ZM-0166）、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔抗体（批号：GB23303）、HRP 标记山羊抗小鼠抗体（批号：GB23302）、原位末端转移酶标记（TUNEL）试剂盒（批号：G1507-50T）均购于武汉Servicebio生物公司；磷酸脱氢酶（GAPDH，批号：60004-1-lg）、β淀粉样蛋白前体蛋白结合蛋白1（APPBP1，批号：14863-1-AP）、泛素结合酶E2M（UBC12，批号：14520-1-AP）、Bax（批号：60267-1-lg）、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2，批号：12789-1-AP）、多聚二磷酸腺苷（ADP）核糖聚合酶1（PARP1，批号：13371-1-AP）、磷酸化的c-Jun（p-c-JUN，批号：28891-1-AP）、磷酸化的c-Jun氨基端激酶（p-JNK，批号：80024-1-RR）抗体均购于美国Proteintech 公司；泛素样修饰激活酶3（UBA3，批号：ab124728）、磷酸化的p38（p-p38，批号：ab195049）抗体均购于英国Abcam公司。

1.3 仪器

MCO-18AIC 型细胞培养箱（日本三洋公司）；DM500 型倒置荧光显微镜（德国Leica 公司）；EnSpire 型多功能酶标仪（美国PerkinElmer 公司）；5424R 型冷冻离心机（美国Eppendorf 公司）；QT-1型涡旋混合器（上海琪特分析仪器有限公司）；TDL-40B 型低速台式大型离心机（上海安亭科学仪器厂）；PL4002 型电子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；TDL-40B型水平摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；FACSCantoⅡ型流式细胞仪（美国BD 公司）；XS-500 型高压蒸汽灭菌器（日本Tomy公司）；DYY-6D 型电泳仪（北京六一仪器厂）；788BR04036型电泳槽及电转槽（美国Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

将HGC-27 细胞在RPMI 1640 完全培养基（含10%FBS和1%双抗体）中于37 ℃、饱和湿度和5%CO2下培养。

2.2 MTT染色实验检测细胞毒性

培养HGC-27 细胞至对数生长期，胰蛋白酶消化，制成细胞密度为2×104个/mL 的单细胞悬液，以每孔100 μL接种于96孔板。培养24 h后使其完全贴壁，将莽吉柿素母液用完全培养基稀释成终浓度为2、4、6、8、12 μmol·L-1的工作液，每个浓度设置5 个复孔，分别培养24、48、72 h。将MTT 粉末用磷酸盐缓冲液（PBS）制备成质量浓度为5 mg·mL-1的初始溶液，然后用DMEM 基础培养基稀释10 倍，弃去原培养基，96 孔板中每孔添加100 μL，置于37 ℃培养箱培养4 h后，弃去含MTT的基础培养基，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）溶液150 μL。将96孔板用箔纸包裹，置于摇床上水平摇动10 min。用酶标仪在490 nm 处检测吸光度（A）值，并依照公式（1）计算细胞活力。

2.3 平板克隆形成实验考察莽吉柿素对HGC-27 细胞克隆形成的影响

将HGC-27 细胞分为4 组，接种在6 mm 培养皿中，每个培养皿500 个细胞，细胞接种后24 h，培养基分别替换为0、4、8、12 μmol·L-1的莽吉柿素含药培养基。药物处理后9 d 后，将培养的细胞固定、结晶紫染色、风干并拍照，观察细胞集落数目。

2.4 Hoechst染色观察细胞形态

将处于对数生长期的HGC-27细胞接种于6孔板（细胞密度为50×104个/孔），培养24 h，使其完全附着在板上。弃去培养基，用完全培养基配制终浓度分别为0、4、8、12 μmol·L-1的莽吉柿素溶液，加入不同孔中。37 ℃培养箱放置48 h 后，用PBS 洗涤3 次，用4%多聚甲醛固定15 min，并在黑暗中用Hoechst 33258 染色溶液染色30 min，将细胞置于倒置荧光显微镜下观察细胞形态并拍照。

2.5 Western blot实验检测蛋白表达

将处于对数生长期的HGC-27细胞接种于6孔板（细胞密度为50×104个/孔），细胞贴壁后，加入完全培养基配制的终浓度为0、4、8、12 μmol·L-1的莽吉柿素溶液，培养箱中孵育48 h。弃去细胞上清液后，用PBS 洗涤3 次，然后用适量的裂解缓冲液裂解，将其收集到1.5 mL 离心管中。在99 ℃下加热10 min 后，通过SDS-PAGE 分离蛋白质样品。然后将蛋白质转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，电转完成后，将转好的膜放入含有5%的脱脂奶粉封闭液中，室温下封闭1.0～1.5 h，加入相关蛋白的一抗，4 ℃孵育过夜。条带用1×TBST清洗3次，每次10 min，之后加入对应的二抗，室温摇床慢摇，孵育2 h。取出PVDF膜，条带用1×TBST清洗3次，每次10 min。将电化学发光（ECL）发光液均匀地加到剪切的条带上，室温避光反应1 min、显影、定影、扫描胶片。使用Photoshop CS6软件处理结果图，计算蛋白的相对表达量。

2.6 裸鼠移植瘤实验

2.6.1 模型制备 BALB/c 裸鼠饲养在SPF 级动物房内，给予灭菌饲料和双蒸水。室温维持在23～27 ℃，相对湿度维持在49%～51%，采用12 h循环照明方式。

将密度为1×107个/mL 的HGC-27 细胞悬液在无菌条件下注入BALB/c 裸鼠右前肢的腋窝0.2 mL。整个移植瘤实验必须在30 min 内完成，以确保良好的细胞活力。每天观察注射裸鼠的肿瘤状态。接种11 d 后，裸鼠出现圆形或椭圆形的直径>5 mm 的皮下硬结节，表明该模型制备成功。

2.6.2 分组与给药 裸鼠肿瘤体积达到100～200 mm3时，进行分组和给药。裸鼠分为对照组、5-FU 阳性对照组和莽吉柿素组，每组各7 只。莽吉柿素给药组裸鼠按55 mg·kg-1的给药剂量每天腹膜内注射莽吉柿素。对照组裸鼠每天注射相同体积的空白溶剂（含有5% DMSO 和2.5%聚山梨酯-80 的PBS）。参考相关文献，阳性药物组按30 mg·kg-1每2 d向裸鼠腹膜内注射5-FU溶液，连续给药24 d[11]。

2.6.3 肿瘤抑制率计算 给药后每天观察裸鼠的一般状态，称量裸鼠体质量，以评估莽吉柿素对裸鼠体质量的影响。用游标卡尺测量皮下移植肿瘤的最大直径（a）和横向直径（b），并详细记录。根据公式（2）～（3）计算肿瘤体积（V）和肿瘤抑制率（IR）。

2.6.4 移植肿瘤的组织学评估 对裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏进行苏木精-伊红（HE）染色。免疫组化法检测肿瘤组织中Ki67 蛋白表达情况。TUNEL染色检测细胞凋亡。

2.7 数据统计

实验数据运用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析，实验数据用（）表示，各组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 莽吉柿素对HGC-27细胞增殖的影响

不同浓度的莽吉柿素作用不同时间对HGC-27细胞活力的影响见表1。结果表明，莽吉柿素能够显著抑制HGC-27 细胞的增殖并且呈时间和浓度依赖性，其作用于HGC-27 细胞24、48、72 h 的半数抑 制 浓 度（IC50）分别 为（9.74±0.97）、（6.85±0.37）、（4.79±0.07）μmol·L-1。根据莽吉柿素的IC50结果，采用4、8、12 μmol·L-1的莽吉柿素进行后续实验。

表1 不同浓度莽吉柿素作用不同时间对HGC-27细胞活力的影响（,n=3）

表1 不同浓度莽吉柿素作用不同时间对HGC-27细胞活力的影响（,n=3）

结晶紫染色结果（图1）显示，与对照组比较，莽吉柿素12 μmol·L-1给药后HGC-27 细胞集落数目明显减少，莽吉柿素能够明显抑制HGC-27 细胞的集落形成（P<0.01）。

图1 莽吉柿素对HGC-27细胞集落形成的影响（,n=3）

3.2 莽吉柿素对HGC-27细胞凋亡的影响

Hoechst 33258 可穿透细胞膜，使细胞发出蓝色荧光的低毒性DNA 染料，正常细胞在染色后细胞核呈现均匀弥散的蓝色荧光，细胞发生凋亡时，细胞膜通透性发生变化，因此染色后细胞核呈现颗粒块状的亮蓝色荧光[12]。Hosechst 染色结果（图2）显示，与对照组比较，莽吉柿素处理HGC-27细胞48 h后，细胞形态发生明显变化，细胞核呈现亮蓝色荧光，并具有浓度依赖性，表明莽吉柿素可促进HGC-27细胞凋亡。

图2 莽吉柿素对HGC-27细胞形态的影响（标尺为50 μm，400×）

如图3所示，与对照组比较，莽吉柿素处理48 h后，HGC-27 细胞中凋亡标志物PARP1 的剪切水平升高，细胞中的凋亡蛋白Bax 的表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平下调（P<0.001）。

图3 莽吉柿素对HGC-27细胞凋亡的影响（,n=3）

3.3 莽吉柿素对HGC-27 细胞中Neddylation 修饰途径的影响

Western blot 结果（图4）显示，与对照组比较，莽吉柿素作用48 h 后，除莽吉柿素4 μmol·L-1组APPBP1 蛋白外，各组HGC-27 细胞中APPBP1、UBA3及UBC12的表达水平均下调（P<0.001）。

图4 莽吉柿素对HGC-27细胞Neddylation修饰途径的影响（,n=3）

3.4 莽吉柿素对HGC-27 中MAPK 信号通路相关蛋白表达的影响

MAPK 信号通路蛋白Western blot 结果（图5）显示，与对照组比较，莽吉柿素作用48 h后，HGC-27细胞中JUN、JNK 和p38 的磷酸化水平均发生了下调（P<0.001）。

图5 莽吉柿素对HGC-27细胞中MAPK信号通路的影响（,n=3）

3.5 莽吉柿素对HGC-27 细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

与对照组比较，莽吉柿素给药后裸鼠的体质量没有明显改变，肿瘤体积缩小18.7%，结果见表2～3。整个实验过程未出现荷瘤鼠死亡。莽吉柿素干预前14 d，各组裸鼠肿瘤生长速度趋势一致，14 d 后各组别肿瘤生长呈现出不同趋势，其中模型组瘤体体积增长速度最快，其次是5-FU组，再次为莽吉柿素给药组。给药24 d 后，与对照组比较，5-FU 组和莽吉柿素组裸鼠的瘤体积均呈现出不同程度缩小趋势，差异有统计学意义（P<0.05）。并且，莽吉柿素组裸鼠的瘤体积小于5-FU 组。

表2 HGC-27细胞移植瘤裸鼠体质量变化（,n=7）

表2 HGC-27细胞移植瘤裸鼠体质量变化（,n=7）

HE 染色结果显示（图6），与对照组比较，莽吉柿素组裸鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的形态特征没有明显变化。免疫组织化学染色结果显示（图7），与对照组比较，莽吉柿素组与肿瘤细胞增殖有关的标志蛋白Ki67 阳性细胞数明显减少，提示莽吉柿素可以抑制肿瘤细胞增殖。TUNEL 染色结果（图7）表明，莽吉柿素组裸鼠肿瘤组织切片中的棕色细胞数量明显增加，表明莽吉柿素可以促进肿瘤细胞凋亡。

图6 莽吉柿素给药后HGC-27细胞裸鼠异种移植瘤模型各器官组织HE染色（标尺为50 μm，400×）

图7 莽吉柿素给药后HGC-27细胞裸鼠异种移植瘤模型的免疫组化染色分析（标尺为50 μm，400×）

表3 HGC-27移植瘤裸鼠肿瘤生长情况（,n=7）

表3 HGC-27移植瘤裸鼠肿瘤生长情况（,n=7）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 讨论

研究发现抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡，可以有效抑制肿瘤的生长[13-19]。莽吉柿素具有良好的抗肿瘤作用[20]，然而其对胃癌的作用效果和相关作用机制还不是十分清楚，有待于进一步阐明。本研究发现莽吉柿素能够明显抑制HGC-27 细胞的增殖能力。

目前，很多临床上使用的抗癌药物通过诱导细胞凋亡来引发癌细胞死亡[21-24]。PARP 蛋白是存在于细胞核中用以重组与修复DNA 的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，PARP 蛋白被活化的Caspase-3 剪切，是细胞发生凋亡的重要标志。本研究发现，莽吉柿素能够上调PARP1 的剪切水平和Bax 蛋白表达水平，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。因此推测莽吉柿素诱导HGC-27 细胞凋亡可能与促进Bax 表达、抑制Bcl-2表达的途径相关。

Neddylation修饰是蛋白质翻译后修饰方式之一，不仅可以造成多种底物蛋白泛素化降解，还可通过修饰底物蛋白，广泛参与多种信号传导途径的调节[25-26]。Neddylation 修饰与肿瘤发生发展关系密切，广泛的参与调控肿瘤的细胞周期、凋亡、衰老、自噬、血管生成以及免疫细胞等多种过程[27]。本研究发现，莽吉柿素作用之后，HGC-27 细胞中APPBP1、UBA3 及UBC12 的表达水平均发生了下调。因此推测，抑制人胃癌细胞HGC-27 中MAPK信号通路相关蛋白的Neddylation 修饰可能是莽吉柿素抑制HGC-27细胞生长的机制之一。

MAPK信号通路在调节细胞增殖、凋亡、分化、迁移和黏附等过程中发挥了重要作用。c-Jun、JNK与p38 的表达失调与肿瘤的发生发展密切相关，研究表明，c-Jun、JNK 和p38 抑制剂可以有效抑制肿瘤的生长[28]。田颖颖等[11]研究发现，抑制MAPK 信号通路可能是槐耳清膏抑制NCI-H1299 细胞生长和转移的机制。本研究发现，莽吉柿素给药能够抑制HGC-27细胞c-Jun、JNK和p38的磷酸化水平，提示在HGC-27 细胞中莽吉柿素能够抑制MAPK 信号通路。因此，推测MAPK 信号通路的下调可能部分介导了莽吉柿素抗胃癌作用。

体内抗肿瘤研究表明，腹腔注射给药55 mg·kg-1的莽吉柿素后，裸鼠移植瘤的生长得到了显著抑制，而体质量、精神状态、饮食和饮水未受明显影响。肿瘤组织HE切片染色结果表明，与对照组相比，莽吉柿素对裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等器官组织并没有表现出明显毒性。

Ki67 蛋白的表达水平通常被用来评估细胞的增殖水平，Ki67 蛋白含量越高表明细胞增殖活性越强[26]。免疫组化实验结果表明，在注射了莽吉柿素的裸鼠体内，Ki67 蛋白的表达水平显著降低，提示莽吉柿素使HGC-27细胞的增殖活性受到抑制。

TUNEL 实验通常用于分析组织或细胞的凋亡[29-30]。本研究结果显示，与对照组相比，莽吉柿素组裸鼠的肿瘤组织细胞凋亡明显增强。因此，莽吉柿素可通过阻止肿瘤细胞增殖并促进肿瘤细胞凋亡而明显抑制裸鼠HGC-27细胞移植瘤的生长。

综上所述，体外研究发现，莽吉柿素能够抑制HGC-27细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制其类泛素化修饰过程。莽吉柿素还能够抑制HGC-27 细胞中MAPK 信号通路。体内研究发现，莽吉柿素能够显著抑制裸鼠体内HGC-27 细胞移植瘤的生长。因此，推测莽吉柿素是潜在的天然抗胃癌活性成分，具有一定的临床开发价值。