非酒精性脂肪性肝炎新药研发临床终点评价

佟小非，孙亚朦，尤 红

首都医科大学附属北京友谊医院 肝病中心，国家消化系统疾病临床医学研究中心，北京 100050

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血压、高脂血症等代谢综合征相关的肝脏疾病。组织学上将NAFLD归类为单纯性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和NASH相关的肝纤维化、肝硬化[1]。目前，NAFLD的发病率逐年上升，全球约有25%的人口患有NAFLD[2]，2019年我国的NAFLD患病率已高达29.8%[3]。NASH是NAFLD进展中的重要环节，可导致肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌等，对患者和社会造成重大的健康和经济负担。然而，目前尚无通过随机对照临床试验确证有效性和安全性的NASH治疗药物上市，新药的研发是迫切的临床需求。在新药研发中，临床结局的改善是评价药物疗效的硬终点，但对于NASH患者尤其是未合并肝硬化者，临床结局的观察通常需要数年的时间。因此美国食品药品监督管理局(FDA)、欧洲药品管理局(EMA)以及我国食品药品监督管理局允许在NASH药物研究中合理使用“替代治疗终点”。而“替代治疗终点”如何定义以及是否可以反映临床结局和获益是新的挑战。

1 临床结局改善是NASH新药评价硬终点

NAFLD和NASH新药研究的重要临床结局是全因死亡率和肝脏相关死亡率。改善临床结局是NASH药物治疗的目标。全因死亡率是许多可能导致死亡的慢性疾病治疗方法临床试验的关键终点评估，包括NAFLD和NASH[4-5]。肝脏相关死亡是全因死亡的一个组成部分，与腹水、肝性脑病、静脉曲张破裂出血、肝细胞癌、急慢性肝衰竭等肝脏失代偿症状密切相关[6]。虽然全因死亡率和肝脏相关死亡率的降低是NASH药物疗效评价的理想终点，但NASH进展为肝硬化是缓慢的，研究[4-7]显示平均7年肝纤维化进展1期，15%～20%的NASH患者可进展为肝硬化，NASH肝硬化的年发生率为4%[6-8]。NASH疾病发展缓慢的特点给治疗药物的研发带来一定挑战性，若要证明治疗药物能够降低疾病的死亡率，对于早期的NASH患者需要10～15年的观察期，这使得以临床结局的改善作为新药研发的终点缺乏可操作性，尤其对于非肝硬化NASH患者。

2 多个指南/指导原则明确可将组织学作为NASH新药研发的替代终点

2.1 NASH的病理表现和评价体系 NASH的组织学特征包括大泡性脂肪变性、肝细胞气球变性、散在的小叶性炎症和凋亡小体、Mallory-Denk小体等。脂肪变性：在疾病的早期，脂变最严重的改变在腺泡3区，随着疾病进展脂肪变性可均匀分布于整个肝腺泡或不规则分布。小叶炎症：NASH炎症主要为以小叶分布为主的混合炎性浸润[9]，门静脉炎症虽不是诊断所必须的，但其严重程度与纤维化程度有关[10-11]。气球样变：气球样变是NASH中最重要的特征，典型的气球样改变的细胞是诊断NASH的重要证据[12]。纤维化：NASH纤维化通常始于3区窦周，显示出典型的“鸡笼样”改变。随着疾病严重程度的增加，门静脉也可出现纤维化，并发展为桥接纤维化和肝硬化。

目前被普遍接受的NAFLD/NASH主要病理评价体系包括：(1)Brunt系统，主要应用于成人NASH的病理评价[13]。(2)美国NASH临床研究网络(CRN)提出的NAFLD Activity Score评分系统[14],该评价系统将NASH的病理表现归类为脂变、小叶炎症、气球样变3个组成部分，NASH疾病活动的程度即为3个组分评分的总和。NAS CRN系统由于对NASH疾病程度评价细致，因此作为组织学评价的标准广泛应用于NASH临床试验和药物研究中。(3)欧洲SAF/FLIP评分系统[15],该系统将NASH的评价分为脂变、活动度以及纤维化。SAF/FLIP 评分系统的优点在于其囊括了NASH和纤维化的评价，并不存在不确定区域，因此适合用于临床诊断。(4)儿童NAFLD评分系统[16],NAFLD儿童评分系统侧重于门静脉周围炎症的评价。

2.2 基于组织学的替代终点 为了满足NASH新药研究的需求，目前的新药研究使用临床硬终点的替代标志物。替代标志物需要经过研究论证，能够预测具有临床意义的终点结果，既能反映疾病进程的变化，同时也与疾病的发病机理密切相关。替代终点通常需要能够满足两点要求：(1)可预测临床获益；(2)可以预测不可逆的发病率或死亡率。

NASH组织病理学的典型表现可以为疾病的进展或逆转提供信息，并且具有灵活、短期内可评价的特点。肝纤维化的进展以与肝脏相关结局密切相关[17]，近期多项研究[17-20]显示，肝纤维化程度是NAFLD长期预后关系最密切的影响因素，晚期纤维化与总体生存率的降低和肝脏相关死亡率的增加相关。而NASH疾病活动程度又是肝纤维化进展的促进因素，脂肪性肝炎的组织学缓解与纤维化的改善密切相关[21-22]，所以NASH的进展程度同样需要关注。

2018 年FDA发布了NASH伴肝纤维化治疗药物的研发指南草案[23]，对于中度或桥接纤维化的NASH(纤维化2期和3期)，肝组织学改善可以作为治疗终点，加快审批过程。2019年美国肝病学会和欧洲肝病学会对NAFLD临床试验终点的联合报告[24]中指出，可以接受组织病理学作为NASH新药试验的替代终点。对于非肝硬化NASH研究，Ⅱb期的药物临床试验建议使用的组织学替代终点为：NASH改善，纤维化不恶化(NAS评分降低≥2分，其中至少1分是小叶炎症或气球样变)；或纤维化好转1期及以上，NASH不恶化。Ⅲ期临床试验可接受的组织学替代终点为：NASH消退(气球样变消失，小叶内炎症灶的减少或消失)，纤维化不恶化；和/或纤维化好转1期及以上，NASH不恶化。对于代偿期NASH相关肝硬化的临床试验，仍建议继续使用以临床结局的改善为终点评价[23]，但组织学的改善也是Ⅱ/Ⅲ期临床试验重要治疗终点之一，即肝纤维化好转至少1期，NASH无恶化[24]。

我国食品药品监督管理局在2019年颁布了《非酒精性脂肪性肝炎治疗药物临床试验技术指导原则(试行)》[25]，其中对于NASH新药研发的“后期探索”阶段，推荐以组织学改善为主要疗效指标：(1)NASH改善，同时纤维化无恶化；或者，(2)肝组织纤维化改善1分及以上，同时NASH无恶化；或者，(3)NASH改善同时肝组织纤维化改善1分及以上。NASH改善定义为NAS评分至少降低2分，其中气球样变至少降低1分，脂肪变评分不增加。在确证性临床试验阶段，对于无肝硬化的NASH患者，目前可接受的肝组织学替代终点包括脂肪性肝炎和/或纤维化的改善，推荐：(1)NASH缓解同时，纤维化无恶化；或者，(2)肝组织纤维化改善1分及以上，同时NASH无恶化；或者，(3)NASH缓解同时肝组织纤维化改善1分及以上。NASH缓解定义为NAS评分中炎症评分为0～1分，气球样变评分为0分，脂肪变评分不增加。

2.3 组织学作为替代终点可能存在的问题 组织学可以作为NASH新药研究替代终点，主要依据既往研究中组织学与预后的关系，结合临床治疗经验和病理生理学的证据，认为有“合理可能性”来预测临床获益[26]。但目前仍缺乏足够的证据证明达到组织学的替代终点者，NASH相关肝硬化失代偿、肝细胞癌发生、肝脏相关死亡率及全因死亡率也明显降低。在NASH新药研发中，需要进一步研究来证明临床获益，以及对于临床结局的改善。FDA肝脏病学与营养学部对于NASH新药研发最新指导意见中强调，如果新药研发基于组织学疗效终点而获得加速审批，仍需要进行Ⅳ期临床结局的研究来验证疗效，Ⅳ期疗效验证研究的成功意味着申办方开发的药物可以获得全面的上市批准[23]。我国食品药品监督管理局同样建议进行临床试验确证临床结局的获益，除上述结局事件的评估外，对于NASH无肝硬化的患者，还包括进展至肝硬化。

此外，组织学纤维化改善1期是较为普遍接受的替代治疗终点。然而，研究显示许多安慰剂组患者也得到了组织学的改善，一项对NASH药物临床试验安慰剂效应的Meta分析[27]显示，安慰剂组NAS评分升高≥2分的比例仅为25%(95%CI: 21%～29%)，主要原因是参加临床试验的过程可以使受试者接收到且主动依从饮食的建议并开始锻炼，达到体质量下降的效果，从而导致安慰剂效应比预期高，而观察药物的差异却低于预期值。因此有学者提出，是否应该制定更为严格的标准，如纤维化好转2期及以上，以增加特异性并降低安慰剂效应，但因此可能会带来增加样本量和延长试验时间等问题。

尽管组织学是NASH诊断及分级的金标准，但其本身仍有局限性，如严重的(约40%)抽样误差[28]、样本长度以及汇管区数量不足等[29]，可能导致病理评估不充分或分级不准。另外一个重要挑战是不同病理学家之间诊断的一致性问题(组间差异性)，有时甚至与他们自己先前的诊断不一致(组内差异性)[30]。针对以上问题，我国食品药品监督管理局要求NASH临床试验中要严格遵循病理样本的标准操作流程(standard operation procedure，SOP)，为减少组织病理学评价的差异，采用中心阅片方式，建议由2名及以上肝脏病理专家进行双盲读片[25]。FDA建议通过对病理医师的培训，提高病理评价的一致性，例如建立中央病理评审委员会，至少2名经过培训的病理专家共同阅读基线和治疗后的切片，决定NAS的各个组成部分的评分，申办方应在Ⅲ期临床试验开始前详细审查肝穿的执行过程以及结果的判读[23]。

近期人工智能在NASH病理评价中得到了应用，一项研究[31]采用双光子显微镜技术为基础的纤维化参数(q-FP)来定量评价NASH纤维化水平。另一项研究[32]采用双光子/二次谐波方法，量化NASH组织学中脂变、小叶炎症、气球样变等组分。人工智能在NASH病理评价中的应用，可能为提高病理诊断的一致性带来新的可能性。

3 探索性终点——基于无创标志物的终点

目前正在开发的NASH药物主要分为三大类: 改善代谢类、抗炎类和抗纤维化类。NASH药物临床试验的早期探索阶段采用的终点，取决于该药物内在的作用机制。药物的代谢效应、抗炎、抗纤维化效应仍在概念验证阶段，是否以及如何转化为肝组织学的改善尚不明确，因此可以考虑以影像学、血清学、NASH肝纤维化无创模型等作为药效学指标，进行小样本、短疗程的药动学/药效学评估，全面了解药物的暴露/效应作用特点，为后续临床试验提供指导。目前包括我国、美国等食品药品监督管理机构，允许在临床试验概念验证的早期阶段，以及药物研发的后期作为次要以及探索终点使用无创的生物标志物(即剂量探索阶段或 Ⅱb/Ⅲ 期临床试验)，并鼓励临床研究使用和开发无创生物标志物，使可靠性强、一致性好的无创标记物可以作为疗效的替代终点来反映临床获益。

3.1 影像学评价 肝细胞脂肪变是NAFLD的重要病理改变，在非肝硬化患者中，肝脂肪变性的完全消除可能伴随着NASH的改善[33]。在以降低肝脂肪为靶点的NASH药物的Ⅰ/Ⅱa期临床试验中，越来越多研究倾向于使用MRI质子密度脂肪分数(MRI-PDFF)定量评估肝脂肪变性作为主要疗效终点。MRI-PDFF具有无创、定量、重复性好等优点，可以测量整个肝脏各个区域的脂变，对细微的脂肪比例变化较为敏感[34]，在规范培训和良好质控的前提下，可以用MRI-PDFF 改变的绝对值或者相对百分比评价以肝脂肪变为治疗靶点的药物。

基于弹性成像的方法确定的肝硬度，包括瞬态弹性成像(VCTE)、磁共振弹性成像(MRE)和剪切波弹性成像(SWE)提供了肝纤维化程度的较为准确的评价。但目前尚无充分证据表明，基于弹性成像的影像学方法可以预测NASH肝纤维化的变化。一项研究[35]显示，VCTE检测肝硬度(LSM)增高的NAFLD患者，30%重复检测后LSM值可在正常范围内。由于VCTE受到肝脏炎症、胆汁淤积、操作规范等多因素影响，尚不能作为判断纤维化疗效的替代终点。MRE在不同的纤维化分期均具有较高的准确性[36]。在一项selonsertib的Ⅱ期临床试验[37]中，MRE预测6个月内纤维化ROC曲线下面积(AUC)为 0.62，包含基线的MRE值可使AUC增至0.79。另有研究[38]显示MRE测量的肝硬度值下降15%，组织学肝纤维化则下降1期。以上研究表明MRE有可能成为判断肝纤维化的替代终点，但是需要进一步验证。

3.2 血清学评价 血清学无创评价指标包括：(1)糖脂代谢相关，体质量、BMI、空腹血糖、糖化血红蛋白、胰岛素抵抗(如HOMA-IR)、血脂等。(2)肝脏炎症/损伤相关，ALT、AST、CK18片段等。(3)肝纤维化相关，FibroTest、ELF、NAFLD纤维化评分(NFS)、Pro-C3、FIB-4、APRI等。在NASH新药研究中，可考虑将无创血清学指标作为药效观察的次要或探索终点。虽然许多非侵入性生物标志物正在研究中，以期作为临床研究的替代标志物，但目前为止并没有证据显示无创血清标志物可以预测临床获益，仍需进一步研究来寻找可靠性强、一致性好的无创血清标志物用于未来的临床研究。

3.3 其他 用于评价肝硬化临床结局的指标包括肝静脉压力梯度和肝功能Child-Pugh评分、MELD评分的变化。既往研究显示，以上评分或模型与肝硬化失代偿等终点事件有较强相关性，在NASH合并肝硬化患者的新药研发中有作为候选替代终点的潜力，然而仍需要进一步验证其反映治疗预后变化和临床结局的能力。

4 总结

NAFLD及NASH的疾病负担日益增加，而目前尚无有效治疗药物是迫切需要解决的问题。NAFLD/NASH的治疗目标是延缓、阻止、逆转疾病的进展，改善临床结局，包括降低肝硬化及其并发症的发生，降低肝移植的需求，提高存活率，改善生活质量等。然而，作为硬终点的临床结局的观察时间过长，不能满足亟待解决的临床治疗需求。对于无肝硬化的NASH，药物的早期概念验证阶段可采用无创评估方法，包括MRI-PDFF、MRE等影像学改变，以及肝脏疾病特异性的血清学指标的变化等共同评价肝脂肪含量、炎症和纤维化。在后期探索和确证性临床试验阶段，评估药物疗效的终点集中于改善NASH和纤维化的组织学特征。同时，需要长期随访来评估这些组织学替代终点是否与硬终点的改变平行。对于合并肝硬化的NASH新药研发，应结合临床结局、组织学以及无创指标共同作为疗效终点。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：佟小非负责文献检索，文章框架设计，论文撰写；孙亚朦负责论文修订；尤红负责文章结构和关键内容审定，终审定稿。