非酒精性脂肪性肝炎新药研发的一些关键因素

郭朝阳，芮法娟，李 婕

山东大学附属山东省立医院 感染性疾病科，济南 250021

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏疾病，疾病谱包括非酒精性肝脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、NASH相关肝硬化和肝细胞癌(HCC)等。NAFLD的患病率随着肥胖、血脂异常、糖尿病等代谢综合征(MS)相关疾病的流行呈逐年增长趋势，目前已成为全球的第一大慢性肝病[1]。本研究组对亚洲的NAFLD患病率进行荟萃分析，结果显示亚洲国家普通人群中NAFLD患病率为29.62%，中国大陆高达29.81%[2]。若不采取有效的干预措施，25%的NAFLD患者会进展为NASH，NASH患者10～15年内肝硬化发生率高达15%～25%[3]。因此，NASH已成为严重的全球性公共健康问题，是日益增长的肝硬化和肝癌的主要原因之一[4]。

NASH的治疗目标是延缓、阻止、逆转疾病的进展，改善临床结局，包括降低肝硬化及其并发症的发生，降低肝移植的需求，提高存活率，改善生活质量等。然而，目前的干预措施除改变生活方式(饮食及运动干预等)实现减重可使部分患者获益外，尚无临床试验确证有效和安全的治疗NASH药物。即使在接受减重手术的NASH伴肝纤维化患者中，50%以上的患者肝纤维化程度并未改善甚至恶化，因此针对NASH患者肝脏损伤的药物治疗至关重要[5]。NASH新药研发过程中的一些关键因素更新迅速，我国和美国食品药品监督管理局(FDA)均针对NASH药物研发发布临床研究指南征求意见稿[6-8]，但因疾病发病机制复杂、患者异质性大等而面临诸多挑战，虽然目前有超过50种治疗药物正处于临床研发阶段，但临床试验成功率低，对该领域患者的临床治疗需求未得到满足，仍存在诸多关键未决问题。

1 目标研究人群临床表型的复杂性

NASH的发病机制至今尚未明确。之前多数学者支持以线粒体反应氧体系(ROS)为核心的氧应激和脂质过氧化对肝脏造成的进一步损伤理论，即“二次打击”理论。随着临床和基础研究的深入，目前NASH被认为是一种与胰岛素抵抗、氧化应激、脂质过氧化和MS的各种表型密切相关的疾病[9]。

临床上NASH患者常同时合并2型糖尿病(86.29%)、高血压(85.23%)、高脂血症(79.81%)、心血管疾病(35.76%)、肺部疾病(18.10%)、肾衰竭(15.77%)和甲状腺疾病(14.95%)等代谢相关疾病[10-12]。但有的NASH患者无肥胖和高血压等MS表现，而有的则可能伴随一种或多种MS组分。因此，临床上肝脏和肝外病变不同严重程度组合，决定了NASH患者的临床表型非常复杂，这些复杂的临床表型不仅会促进疾病进展，其对疗效的影响亦不可忽视。某一类NASH的新药，可能对所有的表型都有效，也可能只是对某个表型有效，对其他表型无效甚至有害。例如乙酰辅酶A羧化酶(ACC)是脂肪合成中的关键酶，在调节代谢中发挥重要作用。ACC抑制剂在临床研究中能有效降低肝脏脂肪含量，但却意外升高血浆甘油三酯(TG)，带来了心血管的安全隐患；尽管法尼酯衍生物X受体(FXR)激动剂奥贝胆酸Ⅲ期临床试验证实会减少肝脏纤维化，但它作为肝脏TG重要的调节因子，长期用药会导致循环胆固醇升高和不良心血管事件发生，而且在亚洲人群的不良反应较高。

此外，由于NASH患者对药物所致的肝损伤敏感性增加，有时药物可能诱发肝损伤加重，以及NASH本身具有增加慢性肾脏疾病的风险，比如过氧化物酶体增殖体激活受体(PPAR)δ激动剂Seladelpar改善NASH的相关指标却增加发生界面性肝炎的风险。因此，在研发药物时应将可能的肝脏毒性以及肾脏损伤性考虑在内，并在临床试验中设立相应的监测计划。对于伴有高血压、糖尿病等合并症的NASH患者，如果同时服用降压、降糖药物，应重点关注NASH新药与以上疾病常用药物合并用药的药物相互作用，是否会影响临床疗效的评价。NASH新药研发需要考虑这些异常代谢因素对药物疗效潜在的影响以及药物是否有加重原有疾病的风险。一个有效的新药在不合适(无效)的人群中开展研究，得到的只能是不正确的结果，从而错误地判断此药无效或者有害。在临床实践中，往往需要针对每一个新药进行评估，综合考虑新药的作用靶点、临床定位、临床前研究和前期临床研究的有效性和安全性等，从而选择纳入临床试验的真正合适的患者群体[13]。例如，随机分组时可以考虑针对不同合并症采用分层随机化的方法，如考虑糖尿病、高血压等并存疾病因素，避免药物影响原有疾病。因此，药物研发方案设计中针对目标研究人群的考虑，实则是设定一个NASH新药的真正合适的患者群体，这对新药成功研发是非常重要的。

2 起始治疗节点以及临床治疗终点的合理性

关于NASH起始治疗节点的选择，一般认为，对药物的依赖性应该是只有进展到NASH才形成。但从内分泌角度来看，单纯性脂肪肝(不伴有NASH)作为内脏肥胖的标准，就应该进行干预，只有脂肪肝早期治疗才能阻断其进展NASH和纤维化/肝硬化；同时又能减少脂肪肝诱发的全身代谢紊乱。而从肝病角度来看，只有晚期纤维化患者中肝脏相关事件的风险较高，认为NASH临床试验最好的治疗时机是在NASH伴有纤维化阶段(F2～3)，尤其是桥接样纤维化受试者的成本效益和社会获益会更高。特别是这个阶段疾病进展较快，药物治疗能够突显效果，并对肝损伤进展的独立危险因子——纤维化程度能够进行客观评估，这部分患者也是最迫切需要治疗的[14-15]。因此，2018年FDA发表的指南明确指出脂肪肝和轻度NASH不是药物开发的首要目标，这个阶段可以通过改变生活方式进行控制和治疗；需要药物干预的主要是纤维化2～3级的非肝硬化NASH和纤维化4级的代偿期肝硬化，建议根据纤维化评估来确定需要药物治疗的NASH人群。

在药物研发过程中，临床治疗终点的准确选择对于NASH药物疗效的评价意义重大。是否能够反映临床结局、预测临床获益是终点选择的基本原则。NASH新药研发最重要的临床结局是全因死亡率。因此，全因死亡率降低是NASH临床试验的硬终点。肝脏相关死亡率是全因死亡率的一个重要组成部分，常与进展为肝硬化、出现失代偿事件(腹水、食管胃底静脉曲张出血、肝性脑病和肝肾综合征等)、肝移植和进展为肝癌密切相关[5]。一旦患者出现上述硬终点事件，通常意味着死亡风险显著增加。然而，NASH经常与糖尿病、肥胖和心血管等疾病共存。这些疾病互为因果，相互促进[16]。实际上，NASH患者首要死因是心脑血管疾病，而非终末期肝病。这给以全因死亡为主要终点的验证性临床试验带来极大的复杂性；此外，NASH进展为肝硬化的过程通常非常缓慢，如果以全因死亡率和肝脏相关死亡率降低作为主要研究终点，对于大部分早期NASH患者可能需要随访至少长达10～15年才能看到新药的效果，这在新药研发和审批的实践中并不可行[9]。因此，药物研发中关键因素是识别和验证能预测进展为硬终点的替代终点[16-18]。

对治疗NASH的新药而言，替代终点的改善可以反映患者进展为肝硬化、出现失代偿事件和进展为肝癌的风险显著降低，进而预测新药降低全因死亡率和肝脏相关死亡率的临床获益。理想的替代终点应该是在NASH的早期阶段能预测未来向硬终点发展的风险，且在治疗中变化灵敏，可以反映疾病进展风险的降低[6]。目前，常用的替代终点有基于肝脏组织病理学的替代终点，然而组织学作为替代终点仍存在诸多问题。肝活组织检查有一定的风险，不能作为常规多次随访的手段，患者依从性较差。组织学评价质量也受多种因素影响，包括活检方式/类型、穿刺部位、穿刺针规格以及病理学评估的偏倚等[9,19]。近来有大量研究[20-22]致力于用无创的方法诊断或评估NASH和肝纤维化，并取得一定进展，其中包括生化、氧化应激、炎症、凋亡和纤维化的诸多生物标志物或组合指标，以及基于影像学技术的肝纤维化的判断方法，如MRI弹性成像、瞬时弹性成像等。美国FDA认为早期临床试验尝试提供概念验证的证据，或者确定药物的合适剂量，可采用无创的替代评价指标，如肝脏血清转氨酶或者其他生物学标志物作为终点。在Ⅱb/Ⅲ试验中，可以考虑使用与肝脏相关结局联系密切的替代终点如纤维化评分、MRI质子密度脂肪含量测定和MRI弹性成像等[23]。

3 多靶点药物的联合应用

随着对NASH发病机制研究的不断深入，胰岛素抵抗、脂肪毒性、氧化应激、免疫或细胞因子或线粒体功能改变，以及细胞凋亡等共同参与了NASH的发生和发展[24]。针对这些发病机制的靶向干预是当前研究的热点，当前NASH药物研发主要分为三类：调节代谢和能量，调节免疫和炎症，控制纤维化进展[25]。治疗靶点及相应制剂主要有PPARα/δ双激动剂(脂代谢类)、凋亡信号调节激酶1抑制剂(抗氧化抗炎类)、长效胰高血糖素样肽-1受体激动剂(胰岛素抵抗)、FXR激动剂(脂代谢类)、成纤维细胞生长因子-19(脂代谢类)、甲状腺激素受体-β激动剂(脂代谢类)、CC趋化因子受体2和5抑制剂(抗肝纤维化)等[26]。

目前这些治疗靶点的探索分别处在不同的研究阶段，但是多数研究仅仅是围绕单一靶点干预展开。由于NASH的病因复杂，作为MS的一个组分，很难准确地建立一种导致或者驱动肝病进展的病因优先级。目前在研药物的作用靶点相对分散，有的甚至作用靶点也未明确。药物研发的难点在于这些生物信号通路相互交织，互为因果，同时伴随着肥胖、糖尿病以及心血管风险，靶向其中的一个通路或靶点，有时不足以产生疗效甚至带来副作用。而且个体患者发病机理和进展阶段不尽相同，简单说单一靶点药物在不同患者不一定达到相同药效，单靶点治愈NASH的可能性很小。因此，针对NASH发病机制不同靶点的多种药物联合干预，机制互补的组合尤其值得期待，治疗靶点需要兼顾防治肝脂肪变、炎症、肝细胞损伤及纤维化,如研究中涉及多个药物多靶点联合治疗或固定剂量复方制剂，需要提供联合用药的充分依据，比如抑制ACC导致非饱和脂肪酸的反馈，PPAR通路被抑制，临床表现为TG升高，依靠优化药物分子难以克服，但可以考虑的解决方案是与PPAR或者FXR激动剂联用。此外，与治疗代谢疾病的药物进行联合，可能会给研究带来更多的思路，例如奥贝胆酸导致循环胆固醇升高，可能需要与他汀类药物联合用药[26-27]。

4 可有效预测疗效的体外细胞/动物模型

FDA建议研发人员使用动物模型筛选潜在新药。构建NAFLD合适的模型进行临床前研究，对于测试靶点的合理性和药物的成药性至关重要。理想的动物模型应与人类疾病特征相似，能够模拟人类疾病状态和进程；稳定性好，可重复性高，造模方法简便可行。与人源化模型相比，NASH动物模型中需要对人类疾病的所有元素进行建模，这显然具有较大的挑战性。在临床前动物试验中，动物模型必须解决几个关键问题：能否忠实的复制疾病的所有特征？动物对特定药物的反应是否表明患者也可能有此类反应？另一挑战是啮齿类动物对药物的反应比人类更敏感，从鼠模型中能够看到比人类实际中更多种类的疾病。虽然NASH动物模型众多，但由于这些病理特征难以同时在临床前模型中模拟，没有任何模型能够理想的模拟人类的NASH环境、发病机制和病理特征，不同靶点药物可能在不同的模型中发挥功效，从而导致NASH药物从临床前数据到临床患者疗效的转化率很低[28-29]。目前之所以没有FDA批准的NASH治疗药物，部分归因于缺乏生物学相关的临床前模型。因此，新药研发成功的一个关键点在于选择合适的临床前动物模型，可以密切反映人类的病理生理学对于验证药物靶点和确定药物的作用方式非常重要。

目前，NASH动物模型众多，但没有任何模型能够完全模拟NASH的环境、机制和病理特征。NASH的小鼠模型通常是饮食模型，没有遗传或基因突变因素参与。比如瘦素(ob/ob)缺乏模型，代谢特征明显，但是在无外加条件下，很难发生肝纤维化，最重要的是，在人类NAFLD中，血清瘦素通常呈现升高的状态[28,30]。蛋氨酸胆碱缺乏(MCD)饲料诱导的NASH模型基因表达谱和人类NASH较接近，但缺乏代谢紊乱特征且体质量随试验延长明显降低，与人类NAFLD代谢过程明显不同[29]。化学(CCl4)或者物理损伤(BDL)可以方便地诱导纤维化，但机制上完全有别于NASH。而且，NASH一般与糖尿病、高脂血症、心血管等疾病共存，目前，很少有模型能够综合反映多种疾病共存的特征。在NASH药物研发中，为了结果的可重复性，试验动物尽量保持各种因素统一，然而临床试验中，个体差异无法排除，包括性别、年龄、基因背景、生活习惯、肠道菌群和基础疾病等。这也是临床前结果不能转化的重要原因。而且NASH动物造模时间长，特别是饮食诱导的模型，周期从几个月到1年以上，导致NASH药物研发成本高，效率低[31]。

因此，寻找其他创新的临床前模型也是NASH领域的研究热点。模拟人体3D细胞技术平台，其中就包括模拟NASH的复杂性，提高药物发现和安全性测试效率。目前，无论是在工业界还是学术界，都认为将实验动物模型转向3D细胞模型更有意义，它具有很多技术和实践优势。

5 总结与展望

目前尚无获得批准的NASH治疗药物，考虑到NASH的高患病率、终末期肝病日益加重的负担，研制减缓、停止或逆转NASH的新药具有巨大的临床需求。鉴于尚未有标准来确定哪些NAFLD患者会进展为NASH，目前药物研发的重点放在开发非肝硬化NASH伴肝纤维化的治疗上，而且NASH进展缓慢，并且需要时间来评估临床终点，如肝硬化或生存期。因此，将考虑可以合理地预测临床获益，我国食品药品监督管理局2019版指导原则推荐采用临床结局终点和肝组织学(炎症或/和纤维化)替代终点。此外，由于NASH发病多重作用机制，多同时伴随着肥胖、糖尿病以及心血管等并发症，导致NASH渐进演变及其异质性异常复杂，NASH新药研发需要考虑这些异常代谢因素对药物疗效潜在的影响以及药物是否有加重原有疾病的风险，选择适宜的目标治疗人群对于评价新药的有效性至关重要。目前NASH新药研发缺少适宜的体外模型来测试靶点的合理性和药物的成药性。虽然现有多种针对不同治疗靶点的探索分别处在不同研究阶段，但是多数研究仅仅是围绕单一靶点干预展开的，使得NASH药物研发成功率较低。针对发病机制的多靶向联合干预是当前研究的热点，联合多靶点用药会是未来治疗的一个发展方向。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：李婕负责文章思路设计；郭朝阳、芮法娟负责文献数据获取分析；李婕、郭朝阳、芮法娟负责起草或修改文章关键内容。