茶叶斑病病原菌高粱附球菌Epicoccumsorghinum的鉴定及生物学特性

黄鈜琳 尹桥秀 江仕龙 包兴涛 武娴 王德炉 陈卓

摘  要：为有效控制贵州省独山县茶叶斑病的发生与危害，本文研究了该区域茶叶斑病的病原和生物学特性。结果表明，从该地区茶叶斑病组织中分离的代表性菌株GZDS2018BXT10的菌落形态、分生孢子器、分生孢子和厚垣孢子等形态与高粱附球菌（Epicoccum sorghinum）一致。对ITS、RBP2、TUB、rDNA-LSU核酸或基因进行测序，采用PAUP软件及最大简约法构建多基因系统发育树，结果表明，GZDS2018BXT10菌株与高粱附球菌模式菌株CBS179.80在系统发育树上聚为一支，自举支持率为100%。致病性试验表明，在室内和自然条件下，GZDS2018BXT10菌株可通过损伤方式导致茶树叶部产生病斑，符合柯赫氏法则。因此，确认该区域叶斑病病原为高粱附球菌（E. sorghinum）。菌株可在PDA、OA和MEA培养基上生长，GZDS2018BXT10菌株在OA培养基上生长速率最快，为（0.76±0.01） cm/d，显著高于MEA和PDA培养基（P<0.05），在PDA上最适生长温度为22 ℃，最适pH为6.0。碳素营养和氮素营养均可影响菌丝的生长。

关键词：茶树;高粱附球菌;鉴定;致病性;生物学特性

中图分类号：S435.711      文献标识码：A

Abstract： In order to effectively control the occurrence and damage of tea leaf spot in Dushan County， Guizhou Prov-ince， this paper studied the pathogen and biological characteristics of tea leaf spot in the region. The results showed that the colonies， pycnidia， conidia and chlamydospores of the representative strain GZDS2018BXT10 were identical with the strain Epicoccum sorghinum. The gene or nucleic acid of ITS， RPB2， TUB and LSU were sequenced， then the phy-logenetic analysis was conducted by PAUP software with the method of Maximum parsimony based on multi-locus sequences. The strain GZDS2018BXT10 and E. sorghinum model strain CBS179.80 were grouped together in the phylogenetic tree， and the clade was supported by 100%. The pathogenicity test showed that the strain GZDS2018BXT10 could induce the lesion on tea leaves using wound mode under the conditions of laboratory and field， in accordance with Koch’s rule. Therefore， the pathogen of tea leaf spot was identified as E. sorghinum. The strain GZDS2018BXT10 could grow on PDA， OA and MEA medium. The strain GZDS2018BXT10 grew quickly on OA medium， and the growth rate was （0.76±0.01） cm/d， which was significantly higher than that on MEA and PDA medium （P<0.05）. The optimum growth temperature and pH value on PDA medium were 22 ℃ and 6.0. Both carbon and nitrogen nutrition can affect the growth of mycelia.

Keywords： Camellia sinensis; Epicoccum sorghinum; identification; pathogenicity; biological characteristics

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.028

近年來，贵州大力发展茶产业，茶树的种植面积达3.5万hm2，位居我国第一[1-4]。由于贵州茶区海拔落差大、气候多样、早春气温偏低、倒春寒天气频发、茶树品种多样，导致茶树病害发生频次较高，对茶叶安全生产有一定影响[4]。目前关于贵州茶树病害的研究主要集中在茶轮斑病、茶炭疽病等病害[5-6]。本课题组近年来先后对贵州惠水茶轮斑病的病原菌Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis[7]和茶叶斑病的病原菌可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）[1， 8]、贵州石阡叶斑病的病原菌Phoma segeticola var. camelliae[9]、余庆茶叶斑病的病原Didymella bellidis[3]和茶褐枯病的病原Colletotrichum camelliae[10]、贵州开阳茶叶斑病茶拟盘多毛孢（Pseudopestalotiopsis theae）[11]等进行了鉴定。针对上述茶树病害的病原菌，为筛选高效药剂、合理剂型、研究病原致病的分子机理等，课题组研究了病原菌在体外的生物学特性，如适宜的温度、pH、氮素和碳素等，建立了病原在体外生长的数据模型[9-13]。2018年9—11月，课题组在贵州省独山县的茶区发现由Epicoccum sorghinum等病原菌所致的茶树叶斑病[2]。经田间调查发现，茶树叶斑病发病率较高，部分茶园发病率达85%，病情指数达74，几乎达到了毁园的程度。为进一步明确该地区的病原，并为下一步深入研究该病害的发生和流行规律、药剂体外活性筛选等奠定基础，并提出有针对性的可持续的防治措施，本文在原有病原菌初步鉴定的基础上，继续深入开展了独山县茶树叶斑病菌的形态学特征和分子生物学等病原菌的鉴定、致病性分析和生物学特性的研究。

1  材料与方法

1.1  材料

2018年9—11月，在贵州省独山县百泉镇井桥村朵朝组（107°30′ E，25°48′ N，海拔1100 m）6个茶园的茶树病害枝条上采集了20余个具有典型叶斑病症状的茶树叶片样本，并对其病害特征进行了拍照记录。茶树品种安吉白茶（Camellia sinensis cv. Anjibaicha）、黄金芽（Camellia sinensis cv. Huangjinya）、贵定鸟王种（Camellia sinensis cv. Guiding Niaowang），树龄3～5 a。

1.2  方法

1.2.1  病原菌分离和纯化  采用组织分离法对菌株进行分离[8-9]。具体方法如下：采集具有典型叶斑病症状的茶树叶片，用无菌手术刀剪取病健交界处3 mm × 3 mm的叶部组织，先用75%酒精消毒30 s，5%的次氯酸钠消毒3 min，再用无菌水清洗4次，并置于灭菌纸上干燥后，接种至PDA培养基（potato dextrose agar，北京索莱宝科技有限公司），置于25 ℃培养箱中黑暗培养。待叶片组织长出少量菌丝时，挑取菌落边缘的菌丝至PDA培养基上进行多次纯化，获得代表性菌株GZDS2018BXT10，该菌株保存于本课题组的菌种保藏室，同时，菌株送中国普通微生物菌种保藏中心保藏，菌株保藏号为CGMCC3.20150。

1.2.2  形态学观察  参照课题组前期的研究报道方法[14-15]，将纯化菌株分别接种于PDA、OA（燕麦片琼脂培养基）和MEA（麦芽浸粉琼脂培养基）平板和山梨糖培养基上，25 ℃避光培养7～11 d。观察菌落和菌丝形态，待产生分生孢子后，挑取分生孢子并在奥林巴斯显微镜（Olympus， BX43和FVMPE-RS）下观察病原菌的产孢结构、分生孢子等形态。

1.2.3  致病性测定  采用本课题组方法对分离菌株进行室内和田间致病性测定[1-3]。室内致病性试验采用福鼎大白茶（Camellia sinensis cv. Fu-dingdabaicha），常年种植于大棚温室，茶树树龄为5 a，茶树叶龄为30 d。田间致病性试验的茶树品种为福鼎大白茶，分别在贵州省湄潭县抄乐乡铜鼓井村茶园（107°57′ E，27°67′ N，海拔868 m）和贵州省惠水县七里冲茶场（106°61′ E，N26°8′ N，海拔966 m）完成。接种方式采用损伤方式和无损方式，损伤采用无菌针头针刺4～5个相邻的孔。接种病原采用经PDA上培养6 d的直径约8 mm的菌碟或分生孢子悬浮液（106 conidia/mL）。同时，采用无菌PDA或无菌水作为对照。田间致病性试验在贵州省惠水县七里冲果树场。湄潭实验地的树龄为30 a，叶龄平均为40 d。惠水实验地的树龄为12 a，叶龄平均为30 d。田间致病性试验前30 d，茶园未采用农药进行防治。田间试验采用分生孢子悬浮液和菌碟进行接种，接种是以损伤和无损伤的方式进行，每种处理方法至少设3个重复。

1.2.4  分子鉴定  用无菌刀片在培养了7 d的PDA培养基上刮取菌丝0.1 g，采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取病原菌菌丝DNA。采用ITS序列及RPB2、TUB和rDNA-LSU等基因进行扩增[2]，引物分别采用V9G/ITS4、LR0R/LR7、RPB2-5F2/fRPB2-7cR、TUB2Fd/ TUB4Rd[14]。采用HS Taq酶（Takara，宝生物工程大连有限公司）试剂进行PCR检测。反应程序：94 ℃预变性2 min;98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35个循环;72 ℃再延伸5 min。结合所得ITS序列的BLAST比对结果，选择参比序列。利用DNAMAN 8.0软件进行拼接及序列多重比对。利用PAUP v4.0b10（Swofford 2003）及最大简约法（maximum parsimony， MP）构建加和进化树。

1.2.5  病原菌生物學特性生长的测定  不同培养基处理：将菌株GZDS2018BXT10分别接种至OA、PDA、MEA培养基上，待菌落长满后，用微距相机观察菌落形态和菌丝色素。

不同温度和pH处理：参照课题组前期研究方法[13-14]。将活化的菌株GZDS2018BXT10接种到灭菌醋酸纤维膜上（孔径0.45 µm，北京索莱宝科技有限公司）的PDA培养基上，培养温度设19、22、25、31、34 ℃共5个温度梯度;pH设5、6、7、8、9共5个梯度。待其中生长速率最快的一组刚长满时，收集所有处理组样品，刮取菌丝称重。

不同氮源和碳源处理：参照课题组前期研究方法[12]，选择察氏（Czapek）培养基为基础培养基。分别用相同质量的不同氮源或碳源化合物代替其中的硝酸钾或蔗糖。2种处理均在生长2 d后开始测菌落直径。

所有处理培养条件为25 ℃，黑暗培养。设5次重复，试验独立重复3次。

1.3  数据处理

采用SPSS 19.0软件、ANOVA及LSD方法对组间数据进行方差分析。统计学差异采用顺序字母标注法标注。

2  结果与分析

2.1  茶叶斑病的田间症状

据田间调查显示，叶斑病从叶片边缘开始产生，随后病斑面积逐渐扩大。叶面出现淡褐色或者深褐色病斑，病斑边缘有深褐色边界线。病害发生后期，病斑初始侵染点逐渐产生坏死。染病茶树表现出树势衰弱，新梢和新芽形成减少，茶叶产量明显降低。幼龄茶园发生重于成龄茶园，叶斑病多发于海拔较高的茶园，偏施氮肥的茶园发生较重。

2.2  病原菌分离

从采集的20余个样本中，采用组织分离法成功分离出18个菌株，其中，Epicoccum sorghinum菌株分离率达79.4%。此外，也分离到茎点霉属（Phoma sp.）、链格孢属（Alternaria spp.）、亚隔孢壳属（Didymella sp.）等真菌的菌株。

2.3  茶叶斑病病原鉴定

2.3.1  形态学鉴定  菌株GZDS2018BXT10可在PDA（图1A，图1B）、OA（图1C，图1D）和MEA（图1E，图1F）培养基上生长，进行形态学观察和分析。其中，在PDA上接种7 d后，菌落颜色逐渐加深。随着时间延长，菌丝开始分泌色素，正面为粉白色，背面变为褐红色（图1A，图1B）。在OA上接种7 d后，菌落呈淡黄色，边缘白色，有气生菌丝产生（图1C，图1D）。在MEA上接种7 d后，菌落呈淡黄色，蓬松状，菌株分泌出的黄褐色分泌物在菌落中央的表面;菌落正面颜色为褐色，反面呈黄褐色（图1E，图1F）。病原菌在这3种不同培养基上的生长速率表现为OA>MEA>PDA，生长速率依次为（0.76±0.01） cm/d、（0.73±0.02） cm/d、（0.62±0.01） cm/d（P<0.05）（图2）。

菌株在25 ℃和黑暗条件下，接种菌株在山梨糖培养基上培养11 d后，观察到山梨糖培养基上产生了分生孢子器并伴随有大量的分生孢子，分生孢子器颜色为褐色或者深褐色。而在其他碳源培养基上没有产生分生孢子器，大小约43.8～ 597.9 µm（图3B）。分生孢子为单细胞，呈卵形，大小约2.8 （1.8～4.2） µm×5.0 （2.6～6.8） µm（n=50）（图3A）。产孢细胞透明，光滑，形状呈圆形（图3C）。厚垣孢子为单细胞或多细胞，大小约10.0 （3.8～21.1） µm×15.5 （6.16～29.2） µm，呈灰黄色，表面有疣状突起（图3C）。

2.3.2  病原菌的致病性测定  自然条件下，茶叶斑病始发于叶片边缘，病斑面积逐渐扩大，形成不规则病斑，病斑边缘有边界线。后期，病斑中央逐渐开始出现坏死。发病的茶树树势衰弱，新叶抽发较少（图4A）。室内致病性试验表明，健康茶树离体叶片经针刺方法接种病原菌株的菌碟（d=6 mm）或用无菌水配制分生孢子悬浮液，喷洒在处理后的茶叶片上并套袋保湿。在接种2 d后，发现以菌碟接种方式可产生明显病斑，病斑直径约4～6 mm（图4B）;接种4 d后，发现菌碟接种方式产生的病斑扩大不明显（图4C）。与菌碟接种方式的症状相比较，发现采用分生孢子悬浮液接种方式的症状较轻。惠水和湄潭两地的田间致病性试验表明，健康茶树离体叶片经针刺方法接种菌株GZDS2018BXT10菌碟或分生孢子悬浮液接种后，均可产生病斑。随着时间的延长，在接种20 d后，发现病斑在不断扩大（图4D，图4E）。其症状与室内条件所致症状有相似之处，但也存在差异，推测产生这种差异可能与茶树的生理生化状态、茶树叶片的叶龄、接种试验的气候条件有关。

2.3.3  分子生物学鉴定  GZDS2018BXT10菌株的ITS、RPB2、LSU、TUB基因或核酸序列的登录号分别为MK516206、MK852278、MK516207和MK516208。采用BLAST进行比对表明，MK516206与E. sorghinum（MG969856.1）的序列等同值为100%，LSU与E. sorghinum（GU237978.1）的序列等同值为100%，RPB2与E. sorghinum（MH824398.1）的序列等同值为95.75%，TUB与E. sorghinum（MF987525.1）的序列等同值为99%。采用PAUP v4.0b10构建系统发育树，将GZDS2018BXT10菌株鉴定为E. sorghinum CBS 179.80，其自举支持率为100%（图5）。

2.4  病原菌生物学特性

2.4.1  温度对菌株生长的影响  研究发现菌株GZDS2018BXT10在体外适宜生长的温度范围较广，但对高温更为敏感，当温度上升至31 ℃，菌株生长极为缓慢，但菌株尚未死亡。将菌株置于28 ℃或更低温度下，菌株生长恢复正常（图6）。

2.4.2  pH对菌株生长的影响  研究发现GZDS2018BXT10菌株的最适pH为6，其菌落生长速率最快，菌丝丰度最大。当pH高于7时，菌落生长变慢（图7）。但在不同pH条件下，菌丝色素的分泌有较大差异，pH为5、6、7时，色素分泌较多，菌落颜色呈红褐色。当pH为8时，菌落形状不规则，菌丝绒毛状，并伴有黄色分泌物（图8）。

2.4.3  不同碳源对菌株生长的影响  供试菌株GZDS2018BXT10在不同碳源培养基上的生长速率有一定差异。其中，在山梨糖条件下，生长速度相对较慢，有分生孢子的产生。菌株在D-果糖、蔗糖、淀粉、乳糖、山梨糖培养基上产生乳白色菌丝（图9），在甘油和葡萄糖培養基上为白色菌丝。菌丝丰度分析表明，淀粉培养基上的菌丝生长量最多（表1）。

2.4.4  不同氮源对菌株生长的影响  由图10可知，供试菌株GZDS2018BXT010在蛋氨酸、蛋白胨、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、尿素、异亮氨酸的培养基上的生长速率有一定的差异。其中，在蛋氨酸、亮氨酸条件下的生长速率相对较缓慢（表2）。菌株在各种氮源上的色素分泌也不完全相同，可产生白色（图10G）、淡黄色（图10E，图10F，图10H）、乳白色（图10A，图10D）的菌丝。此外，菌丝丰度也不完全相同，菌株在蛋白胨、甘氨酸培养基上产生量最多，在蛋氨酸、亮氨酸培养基上产生量最少（表2）。

3  讨论

本文采用形态学、分子生物学、多基因系统发育树和致病性试验等方法，从贵州省独山县百泉镇井桥村朵朝组茶叶斑病中发现致病菌高粱附球菌（E. sorghinum）。基于LSU、ITS、RBP2和TUB 4个基因或核酸序列，Chen等[16]构建格孢腔菌目（Pleosporales）中最大的家族亚隔孢壳科（Didymellaceae）的多基因系统发育树，并将Epicoccum属列为其中1个clade。本研究将E. sorghinum GZDS2018BXT10等多个代表性菌株鉴定为E. sorghinum CBS 179.80。E. sorghinum CBS 179.80定位在Epicoccum的clade上。研究表明，E. sorghinum最早被称为Phoma sorghina[17]。据Chen等[16]报道，E. sorghinum CBS 179.80是从波多黎各的高粱（Sorghum vulgare）上分离获得，E. sorghinum CBS 727.68是从法国的柑橘（Citrus sp.）上分离获得，E. sorghinum LC4860是从中国的茶树（Camellia sinensis）上分离获得。E. sorghinum可引起烟草[18]、红花酢浆草（Oxalis debilis）[19]、白合[20]、白芨（Bletilla striata）[21]、芋艿[22]、七叶一枝花（Paris polyphylla）[23]、马唐（Digitaria sanguinalis）[24]和卷心菜（Brassica parachinensis）[25]等植物产生叶斑病。在本课题组报道之前，Chen等[16]也从我国茶树上分离获得一个菌株E. sorghinum LC4860，但未详细说明所分离茶树的样本情况以及该菌株是否引起茶树致病。本研究从贵州省独山县茶园的茶树叶斑病病叶中分离获得多种菌株，并发现E. sorghinum GZDS2018BXT10等代表性菌株对茶树叶片可产生病斑，并且在室内和田间条件下所导致的叶部病斑与田间自然发生病害的症状有一定的相似性。然而，课题组也从采集叶部病害组织中分离了多个其他种类的病原菌或内生菌。课题组从病斑产生速率、病斑大小、是否存在子实体等方面初步比较了前期分离的病原菌Phoma segeticola var. camelliae[9]、Didymella bellidis[26]、Alternaria longipes[27]、Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis[7]的致病特征。发现E. sorghinum所致叶斑病的病斑产生速率快于Phoma segeticola var. camelliae、Didymella bellidis等菌株所致的病斑速率，E. sorghinum所致的病斑大于Phoma segeticola var. camelliae、Didymella bellidis

等菌株所致的病斑。E. sorghinum、Phoma segeticola var. camelliae、Didymella bellidi所致的病斑形状与Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis所致病斑形状不同，Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis所致病斑有轮纹状，后期产生子实体[7]。此外，也有研究表明，E. sorghinum可通过真菌复合体的形式，引起高粱产生灰霉病[28]。E. sorghinum也可与其他真菌形成复合体，引起Paspalum guenoarum种子的萌发率降低[29]。因此，不能排除E. sorghinum与其他微生物通过各种形式的相互作用，导致茶树产生叶斑病。

研究E. sorghinum真菌在体外的生长特性，对于该真菌的生物学特性、杀菌剂抑菌活性筛选及作用机制、药剂对靶活性评价及利用率研究等均有重要意义。对菌株GZDS2018BXT10在不同培养基上的生长速率、产孢特性、对氮源和碳源的利用，以及在PDA上最适温度和最适pH进行系统评价，发现GZDS2018BXT10适合在PDA、OA、MEA培养基上生长，该菌株在3种培养基上的大小具有一定的差异。氮源和碳源利用试验表明，菌株GZDS2018BXT10的菌落生长速率和色素分泌与培养基组分相关。温度和pH筛选条件试验表明，菌株在PDA上最适温度为22 ℃，曾慧兰等[30]报道，E. sorghinum在pH同为6的条件下生长速率较快，菌株在PDA上的最适温度为25 ℃，与本研究菌株GZDS2018BXT10的最适pH一致。同时，曾慧兰等[30]研究表明，最适碳源为乳糖、葡萄糖，最适氮源为牛肉浸膏，而本研究最适碳源为葡萄糖、甘油，最适氮源为蛋白胨，二者存在一定差异。因此，课题组将在未来重点开展以下几个方面的研究：（1）E. sorghinum对茶树茎、叶、果和花等组织部位的致病性;（2）E. sorghinum对不同茶树品种的致病性;（3）E. sorghinum对茶树组织致病程度与温度、湿度、光照、茶树树龄等因子间的相关性;（4）E. sorghinum与其他几种微生物菌株在侵染茶树组织间的关系;（5）E. sorghinum及其他几类微生物菌株的代谢物的主要组分对E. sorghinum和其他几类重要微生物菌株的生長、分生孢子萌发形成等影响。此外，课题组系统研究了E. sorghinum在体外适宜生长的温度、pH，在PDA、OA、MEA等培养基上的生长和色素分泌等情况，对今后进行茶树叶斑病药剂筛选、杀菌剂作用机制和田间防控研究等具有重要参考价值。

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责任编辑：谢龙莲