诱导性多能干细胞在心血管领域的研究进展

陈 尘，麦明杰，孙图成，赵明一，朱 平

［1.南方医科大学第二临床医学院，广州 510080；2.广东省心血管病研究所广东省人民医院（广东省医学科学院），广州510080］

提要：随着生活和医疗水平的提升，每年心血管疾病的病死率不降提升，随着干细胞生物学和再生医学的发展，诱导性多能干细胞技术也迅速发展起来，其衍生产品应用到临床越来越多的领域。本文综述了诱导性干细胞的背景，制备诱导性多能干细胞的方法、安全性、有效性以及制备过程中遇到的问题和挑战。

2017 年的全球疾病负担研究表明，自1990 年以来由于人口老龄化和人口增长的推动，包括心血管疾病和癌症等在内的非传染性疾病的总死亡人数稳步上升，而死于心血管疾病的总死亡人数最多，其次是肿瘤和慢性呼吸道疾病，在2007-2017 年期间，心血管疾病的总病死率增加了21.1%，缺血性心脏病和脑卒中占心血管疾病的84.9%［1］。如何改变这种情况并降低死亡人数是很多科学家思考的问题。

干细胞是一种还未完全分化、发育不成熟的细胞，具有自我复制的能力和再生发育成各类组织器官的潜能。在不同条件下，它可以分化成不同功能的细胞。根据发育阶段将干细胞分为胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞（somatic stem cell，SSC）。根据发育潜能将干细胞分为全能干细胞（totipotent stem cell，TSC）、多能干细胞（pluripotent stem cell，PSC）和专能干细胞（unipotent stem cell，USC）。ESC 来源于哺乳动物胚泡的内细胞团，同时具有自我复制增殖和分化成所有3 个胚层的细胞的能力。干细胞的具体分化和发育受着多种因素的影响，动物ESC 在体外的成功培育为人ESC 应用于临床治疗各个系统疾病奠定了基础，然而，用动物ESC 建立的动物疾病模型研究人类疾病可能存在物种差异而影响结果，在临床广泛使用人ESC 领域存在伦理问题，患者移植后也可能出现组织排斥的问题。解决这些问题的一种方法是直接从患者细胞中产生特异性PSC 研究特异性治疗。诱导性PSC（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是指将人类体细胞经过导入外源性转录因子重编程之后所产生的一类细胞，其与ESC 非常相似。两种类型的细胞均表达人多能因子和ESC 表面标志物，并具有分化成3 个胚层的潜力，不同条件下可将iPSCs 诱导分化成为不同的细胞，自十多年前iPSCs 技术问世以来，干细胞生物学和再生医学取得了巨大进步，人类iPSC 已广泛应用于疾病建模，药物发现和干细胞治疗［2］。

近年来，干细胞治疗已经应用到医学多个领域，包括心血管病领域。iPSC 技术的发展拓宽了目前临床上对于心血管疾病的治疗的方向和手段，有效地改善了干细胞研究过程中出现的物种差异、免疫排斥以及潜在的伦理问题，拥有巨大的应用前景。

1 诱导性多能干细胞的制备

目前已知的一些重编程方法包括（1）核移植；（2）细胞融合；（3）使用细胞提取物重编程；（4）直接重编程。早在19 世纪60 年代，科学家John Gurdon 做过从分化成熟的青蛙细胞中取出细胞核并注入去核卵母细胞中最后得到发育完全的青蛙的实验，首次证明了体细胞核的全能性，该实验也表明，在从细胞到个体的分化过程中，没有发育所必需的关键遗传物质丢失。1997 年，通过体细胞核移植（SCNT）克隆绵羊“多莉”，也是将Gurdon 的实验发现应用到哺乳动物上。2001 年Tada 等将胸腺细胞和ESC 通过细胞融合技术进行杂交，杂合细胞表现出了多能性。2006年日本科学家Kazutoshi Takahashi 和Shinya Yamanaka［3］曾报道，在ESC 培养条件下引入4 种因子：Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4（OSKM 因子），进一步诱导来自小鼠胚胎或成体成纤维细胞，能培养得到iPSCs，其表现出ESC 的形态和生长特性，并表达ESC 表面标志物。这些实验都体现了体细胞重编程的可能性。

体细胞重编程过程中的重要环节是基因表达的调节，个体的每个细胞都具有基本相同的DNA 序列和遗传信息，不同的基因表达影响着细胞的分化方向。基因表达的调节基于表观遗传学，例如由DNA 甲基化引起的基因沉默和由组蛋白乙酰化或甲基化引起的染色质结构的变化［3］。以往的研究表明，在转录因子中，Oct3/4、Sox2 和Nanog 可能下调参与诱导细胞分化的基因表达，以维持其未分化特性，并且OSKM 这4 个因子（包括c-Myc）都会引起表观遗传学的变化，如染色质修饰和DNA 甲基化，从而产生iPSC。Nanog、Oct3/4 和Fbx15 的启动子区域在iPSC和ESC 基因表达过程中都有去甲基化［4-5］，体现了表观遗传学对体细胞重编程的重要性。

将重编程之后得到的iPSC 应用于临床虽然能解决物种差异、免疫排斥和伦理问题，但是否会有其他影响，例如癌变？全世界的科学家纷纷展开各种设想和实验，希望能将iPSC 技术在临床应用上尽早达到预期效果。

以往传统的转录诱导方法是使用外源性遗传物质，对自体靶细胞的基因组存在着潜在影响，可能导致诱导失败、靶细胞基因突变，甚至可能出现致癌性，而这就违背了科学家们研究iPSC 应用于临床的初衷。实际上，过去10 年中在小鼠和人类细胞中的其他实验也表明，其他组的转录因子组合在将细胞重编程为多能状态领域同样有效。作为OSKM 因子之一的Myc，偶尔诱导iPSC 衍生的嵌合体小鼠有肿瘤形成［6］。有研究表明，引入3 种转录因子（没有c-Myc）也成功产生了iPSC，通过Myc2 产生的iPSC嵌合体小鼠在研究期间没有发生肿瘤［7］。有研究仅仅使用2 个转录因子（Oct4 和Klf4）即可从成年小鼠神经干细胞诱导出iPSC［4］，因为神经细胞比ESC 表达更高水平的内源性Sox2 和c-Myc，这表明为不同种类的自体细胞寻找适当且最有效的转录因子或转录因子组合，同时找到转录因子起作用的DNA 位点，从而提高安全产生iPSC 的效率，是有效地利用源自干细胞的组织或细胞来治疗疾病的两个关键步骤。

iPSC 还有其他的制备方法。反转录病毒载体用于在初代iPSC 中表达外源重编程因子，仙台病毒、腺病毒等均可以用于重编程，这些病毒可以实现稳定的基因组整合，对于连续的基因表达以及有效的iPSC 产生是有益的。然而，尽管病毒诱导可用于细胞重编程的基础研究，但在重编程后存在转基因被重新激活的风险。腺病毒载体可降低这种风险，但不能降低到临床应用的水平，并且重编程效率低。仙台病毒是单链的RNA 在细胞核外进行复制，被认为是最安全的病毒方法［8］。这为其他科学家开展更多实验研究如何生成更安全的iPSC 衍生的临床产品提供了思路，奠定了基础。

还有科学家通过用微核糖核酸转染的方法重新编码体细胞，以避免使用病毒载体将基因组整合到宿主基因组中，并发现使用三种成熟的微核糖核酸（mir-200c、-302s 和-369s）直接转染小鼠和人类细胞，可以得到表达水平更高的ESC 和iPSC，并且可降低突变率和肿瘤发生的风险［9］。

iPSC 的制备与免疫反应也有一定关联。早期已有报道，toll 样受体3（TLR3）是重编程所必需的［10］，并且白细胞介素-6（IL-6）可促进重编程［11］。还有研究表明，干扰素-g可能阻断内源性逆转录病毒元件或其他转录因子的激活，从而阻止多能状态的激活，此外，干扰素-g 的抑制作用仅表现在过渡到完全多能的最终阶段，而不是在早期阶段［12］。有趣的是，据报道，ESC 具有减弱先天免疫的特性，这表明先天免疫反应可能与多能性不相容［13］。

在产生iPSC 的过程中，有些小分子化合物能促进诱导出iPSC。根据研究表明，目前体细胞重编程过程中起促进作用的小分子化合物主要有CHIR99021、丙戊酸（VPA）、Repsox 等。最早发现的化合物是丙戊酸，它是一种作用于组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的抑制剂，丙戊酸通过促进组蛋白乙酰化，改变细胞整体转录活性，从而将重编程效率分别能提高50 倍（三因子诱导）或100 倍（四因子诱导）［14］。有研究组发现，iPSC 诱导常用的成纤维细胞在重编程过程中会发生间质-上皮转化（mesenchymal-epithelial transition，MET），与正常发育分化过程中常见的上皮细胞向间充质细胞转换（EMT）过程相反；转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路是MET 所必需的信号通路，TGF-β信号通路的抑制剂A-83-01 可以促进上皮细胞向间充质细胞转换，影响重编程速度；该研究还指出，邓宏魁实验室在早期使用Oct4 一个转录因子，同时添加丙戊酸、GSK-3β信号通路的抑制剂CHIR99021、TGF-β信号通路抑制剂616452（Repsox）和LSD-1 抑制剂Parnate，这4 种小分子诱导出了小鼠iPSC，避免了使用原癌基因Klf4 和c-Myc，从而提高了安全性［15-16］。还有许多研究发现，小分子化合物可以调节细胞新陈代谢，小分子化合物直接或间接地激活糖酵解或者抑制线粒体的氧化磷酸化，如使用2，6－二磷酸果糖（F2，6P，PFK1activator）、2，4－二硝基酚（DNP，mitochondriadecoupler）、槲皮素和PS48 这些化合物来提高重编程效率［17-19］。

至于其他问题，例如除了成纤维细胞是否有其他体细胞可以重编程生成iPSC？虽然在产生iPSC 的实验研究中大部分将人成纤维细胞上作为重编程的体细胞来源，但是已经报道了从其他体细胞类型如胰腺β细胞、胃上皮细胞、肝细胞、T 细胞和B 淋巴细胞、角质形成细胞、神经祖细胞和人肾上皮细胞中成功产生iPSC。值得注意的是，血液来源的细胞，如T 淋巴细胞，为重编程提供了一种易于获取和非侵入性的供体细胞［4,20-22］。Maya 等［20］在2015年限制性乳酸盐纯化从人外周血单核细胞产生iPSC，能够根据药物测试或再生医学的需要而产生的大量高纯度的心肌细胞。Katharina 等［23］为了增强人羊水细胞（AFC）的增殖能力，通过用由OCT4、SOX2、KLF4 和c-MYC（OSKM）组成的逆转录病毒混合物转导大量原代人羊水细胞，从而衍生出iPSC，在转导后约7 d 出现AFiPSC 集落，并且比其他人观察到的成纤维细胞衍生的iPSC 早约两周出现。Yasuaki 等［24］也研究了来自人类第三磨牙的骨髓间充质干细胞是否可以通过三种转录因子OCT 3/4、SOX2 和KLF4 的转导来重新编程，最后成功诱导iPSCs。虽然任何人类自体细胞在理论上都可以重编程为iPSC，但许多组织细胞获得的有创性（如神经细胞、心肌细胞等）阻碍了进一步的研究，为了解决这一问题，Zhou 等［25］提出了从尿液中存在的脱落肾上皮细胞产生人类iPSC 的方法，该方法在许多情况下是有利的，因为尿细胞的分离很简单（30 mL 尿液就足够了），成本有效且通用（可应用于任何年龄，性别和种族）。此外，整个过程相当快，尿细胞培养约2 周，重编程3-4 周，使用外源因子的逆转录病毒递送，iPSC 集落的产量通常高达4%。尿iPSC（UiPSC）也显示出极好的分化潜能，因此成为了从正常个体或遗传疾病患者（包括影响肾脏的患者）生产自体PSC 的良好选择。LEE 等［26］在2017年提出用非整合方法重新编程患有唐氏综合征的患者的尿源细胞产生iPSCs，这也降低了这些细胞出现可能影响实验结果的突变的可能性。

然而，值得注意的是，人和小鼠ESC 的维持需要不同的信号传导通路和培养条件。LIF/Stat3 是维持小鼠ESCs中未分化状态所必需的，BMP4 可抑制MEK/ERK 分化途径，从而导致小鼠ESC 自我更新。相反，人ESC 和人iPSC不需要人类LIF，并且多能性的维持似乎主要依赖于FGF和MEK/ERK 信号传导，这表明培养多能细胞的物种特异性要求［27］。

2018 年，Zeng 等［28］报道了microRNAs 是iPSC 产生和分化的重要调控因子。miRNA通常与RNA诱导的沉默蛋白复合物相关，这种作用在高等真核生物的转录后基因调控中起主要作用。miRNA 的应用可以提高iPSC 产生的效率，使iPSC 集落数量的显著增加。此外，miRNA 诱导的PSC（miR-iPSC）可以比传统重编程实验的细胞更快地获得。目前miRNA 诱导的PSC 已被用于研究和治疗各种疾病。

iPSC 的制备目前还有很多值得探索的地方，虽然自体取材诱导的iPSC 有更高的安全性和更低的免疫排斥问题，但是低效率性和低产出率也阻挡了iPSC 在临床上的广泛应用，如何解决这一问题，是许多科学家即将研究的方向。

2 诱导多能干细胞在心血管的临床应用

人类iPSC 技术在人类疾病建模，药物发现和干细胞治疗领域具有巨大潜力，而这种潜力才刚刚开始实现。iPSC 技术引起了人们对再生医学潜在适用性的极大兴趣。第一项评估人类iPSC 衍生细胞的临床研究始于2014 年。该研究使用人类iPSC 衍生的视网膜色素上皮（RPE）细胞治疗黄斑变性，据报道该治疗可改善患者的视力［29］。

2.1 疾病建模

源自患者的iPSC 模型使得可以在培养皿中重现疾病表型和病理学，从患者衍生的iPSC 分化的细胞可呈现分子和细胞表型。如果已知负责疾病表型的基因，则可以通过基因编辑方法确认表型是否与疾病真正相关［30］。

近年来，基于人类iPSC 的心脏病模型的研究已经迅速增加，有研究提出，钠/钾通道功能障碍引起的长QT 综合征是一组与离子通道功能异常有关的遗传性疾病，其特征是心电图上QT 间期延长和因为室性心律失常导致心源性猝死的高风险［31］。长QT 综合征（LQTS）可发生威胁生命的室性心动过速（室速）。尖端扭转型室速可导致晕厥和心源性猝死，病死率高达50%［32］。两种最常见的疾病形式是LQTS1 和LQTS2，占所有患者的40%～55%和30%～35%。这些形式的疾病是由复极化钾通道的α-亚基中的功能丧失突变引起的。LQTS1 和LQTS2 分别来自KCNQ1 和KCNH2 基因的突变，这些基因编码介导延迟整流钾电流的两种不同钾电流的α-亚基。目前已经开发出基于iPSC 的这两种突变模型。该研究还报道了多种心律失常和心肌病，均建立了相应的疾病模型。对于未知的基因突变的疾病，iPSC 的效用不太明显。如果在患者心肌细胞中存在可辨别的功能缺陷，则这些可能存在于源自患者特异性iPSC 的心肌细胞中，并且基于iPSC 的体外疾病模型的创建很复杂。此外，由iPSC 衍生的心肌细胞尚不成熟，而除了先天性心脏病以外，大部分心脏疾病是发生在成体成熟甚至衰老的心肌细胞中的，诱导的幼稚iPSC 并不能很好地研究这些疾病的发展机制。因此，能够产生与成体心肌细胞具有更大相似性的细胞的方案的开发是iPSC 心脏病模型的关键挑战。

2.2 药物发现

除了使用人类iPSC 模型研究疾病发展机制，还可以进行药物筛选和治疗效果的检测，并且已经使用表型或基于靶标的筛选鉴定了潜在的治疗一些疾病的候选药物。iPSC 模型还可以用来筛查药物毒性。新药的开发成本非常高，高成本主要是因为实验过程中的失败，尤其是后期临床试验中的失败，而这些失败又常常是由于意外的副作用。许多新的候选药物在临床前试验中出现了不可预测的副作用，其中心脏和肝脏毒性尤其令人担忧。阿霉素是常见的化疗药物，具有与剂量相关的心脏毒性，可导致部分患者心脏衰竭。但是，哪些患者会发生阿霉素引起的心脏毒性是不可预测的，可以运用患者特异性iPSCs 衍生的心肌细胞，在细胞水平预测患者是否发生心脏毒性。

因此，人们对开发可以更有效地预测候选药物引起严重副作用的可能性的方法有相当大的兴趣，从而能够选择由于后期试验中的毒性而不太可能失败的候选物。

2.3 干细胞治疗

目前干细胞应用于治疗心脏疾病领域主要是涉及修复损伤和再生领域，除了其直接的组织再生作用外，干细胞还可能通过分泌多种生长因子和细胞因子而产生临床影响。干细胞分泌的营养介质通过多种机制的组合改善心脏功能，例如减轻组织损伤，抑制纤维化重构，促进血管生成，动员宿主组织干细胞和减少炎症。干细胞分泌因子的心脏保护作用机制非常重要，目前已知有b 成纤维细胞生长因子/成纤维细胞生长因子-2、白细胞介素-1β、白细胞介素-10、血小板衍化生长因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、基质细胞衍生因子-1，胸腺素-β4、Wnt5a、血管紧张素-1 和血管紧张素-2，趋化因子-1 和促红细胞生成素［8］。

将iPSC 衍生出的心肌细胞移植到心肌梗死区域以补充缺血受损死亡的心肌细胞从而维持心肌的基本功能，或iPSC 衍生的内皮细胞移植于病变的血管，从而恢复供血都是全世界科学家一直在做的尝试。Schenke 等［8］用小鼠成纤维细胞诱导的iPSC 通过形成胚状体（embryoid bodies，EBs），诱导出了功能性心肌细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和造血细胞。这种由iPSC 诱导出来的心肌细胞不仅具有典型的心肌细胞标志物，而且还能产生收缩反应。随后，Nelson 等［33］将iPSC 植入子宫，观察到iPSCs 在子宫内分化为心脏细胞，将这些心脏细胞植入受损心脏后，发现了重新构建的心脏、血管平滑肌、内皮组织具有心肌细胞的收缩性、心室壁厚度和电位稳定性等特征，然而开展临床上移植干细胞的疗效实验未得到成功结果。2001 年，Lee 等［？］的实验结果描述了作为单层的人iPSC 的有效心脏分化的14 d 方案，这个方案诱导的细胞通常产生混合细胞群，其中超过50%是心肌细胞、内皮细胞或平滑肌细胞。当iPSC 分化时，将来自该方案第6 天的细胞注射到大鼠心脏的梗死周围区域；在冠状动脉结扎和再灌注后，能够显示人iPSC 衍生的细胞移植后，分化成心肌细胞和平滑肌，并且在梗死后持续至少10 周。注射iPSC 衍生细胞的心脏显示出在心肌梗死后保护避免功能下降的非显著趋势，通过10 周的磁共振成像评估，使得iPSC 处理的心脏中10 周的射血分数为62%～4%，与对照梗死心脏相比，射血分数只有45%～9%（P＜0.2）。总之，该实验证明了人类iPSC 的有效分化，其产生了保留在梗死的大鼠心脏中的细胞，并且在缺血性损伤后减少了心脏的重构。这是将iPSC 应用于临床治疗心脏疾病重要的一步。2014 年，Lei 等［34］将人iPSC 移植到猪的心肌梗死模型上，结果也证明移植细胞能发育成功形成良好的心肌细胞和血管，可明显改善左心室壁应力、梗死面积、收缩期增厚分数、血管密度和ATP 转换率。

直接重编程方法涉及将人成纤维细胞直接转化为其他谱系特异性细胞，例如神经元，不会消除细胞衰老标记物。实际上，通过直接重编程从老化的成纤维细胞衍生的神经元维持细胞年龄，因此，提供了替代的细胞模型来研究与年龄相关的疾病。直接转换迫使靶体细胞（例如成纤维细胞）表达细胞特异性转录因子并将一个体细胞状态重编程为另一个体细胞状态而不通过iPSC 状态。这又为疾病的建模提供了方向，以后对于成熟体细胞出现的非遗传性疾病，可以尝试用直接转换的方法产生成熟的iPSC，以便研究发病机制与治疗方案。对干细胞治疗也有很大的推动作用。

3 小 结

iPSC 作为同时拥有自我更新以及多向分化的能力的细胞，被寄予着人类从心血管疾病中延缓生命的厚望。从多年前的体细胞核转移的启发研究到十多年前第一次用重编程体细胞诱导出iPSC 的实验，都为干细胞研究的进步奠定了坚实基础，在全世界掀起了挖掘干细胞潜能的风潮。解决的伦理、免疫排斥等问题又再次肯定了iPSC的重要性，在iPSC 诱导过程中所需因子的减少到可以使用非整合病毒等基因编辑等方法，是无数实验失败成功的结果，也是人类在干细胞研究的一大进步，CRISPR-Cas9技术等辅助技术的开发又能大大缩短干细胞进展所需的时间。除了iPSC 的制备，重中之重一直是成功的将iPSC广泛而安全的应用于临床，为人类生命做出巨大贡献，疾病建模和药物检测在干细胞应用中越发出彩的同时，不断出现的新方法比如直接转换体细胞等，虽然看似跳过了iPSC 状态，其实是iPSC 的衍生发展，也同样具有广阔的前景，国外也开展了iPSC 衍生产品应用于临床患者的研究，也期待临床使用iPSC 衍生细胞治疗心血管疾病的研究结果能让干细胞研究谱写出新的篇章。