异丙酚静脉注射对老年患者左心室功能及心肌β肾上腺素受体的影响

杜燕燕，曾琳玲，彭学强，伍嘉艳，刘 鉴

［1.中山市中医院麻醉科，广东中山 528400；2.广东省心血管病研究所广东省人民医院（广东省医学科学院）心外麻醉科，广州510080］

异丙酚是一种短效静脉麻醉剂［1-2］，能保护脑缺血/再灌注损伤后的大脑和脊髓［3］，在临床麻醉中得到了广泛的应用。静脉注射异丙酚后可导致心肌β肾上腺素受体密度降低［4-5］。心肌钙通道在缺血后的异常功能是导致钙离子流入的因素，异丙酚可防止大量钙质在细胞内积聚而引起的心脏骤停，还会影响兴奋收缩耦合，造成负向性效应。交感神经-肾上腺素系统的变化在充血性心力衰竭（CHF）中最为重要［6-7］，交感神经张力的变化可通过肾上腺素受体介导的生物学效应直接影响充血性心力衰竭的进程［8］。人心肌β肾上腺素受体分为β1、β2、β3 亚型，目前对β1与β2 受体的研究较多［9］。β受体阻断药可以减轻心力衰竭患者的症状，逆转心肌重构，但并不对所有心力衰竭患者均有效。钙调神经磷酸酶（calcineurin，CaN）是Ca2+敏感信号物质［10-11］，能在心脏肥厚的发生过程中起重要作用，揭示出一种新的信号传导途径，即CaN途径。

1 资料和方法

1.1 一般资料

2017 年6 月至2018 年12 月在中山市中医院筛选65～75 岁的二尖瓣置换患者46例作为研究对象，共分成2 组，即对照组（n=23）和异丙酚组（n=23）。患者年龄65～75 岁，体质量指数为18～30 kg/m2；无对异丙酚过敏史。入选标准：拟行二尖瓣置换术的患者；患者年龄65～75 岁，术后接受常规治疗。排除标准：肝炎病毒及人类免疫缺陷病毒感染的患者；自身免疫性疾病患者；恶性肿瘤患者；严重的心脑血管等疾病患者；肝及肾功能不全患者。本研究已经获得医院医学伦理委员会批准，且受试者均已签署书面知情同意书。

1.2 试验方法

1.2.1 异丙酚静脉注射 术前，所有患者严禁饮水饮食，患者进入手术室后监测其心电图、无创血压、脉搏氧饱和度、脑电图双频指数（BIS）及插管后监测图末端排出二氧化碳后，异泊酚组患者使用微泵注射异泊酚［2～6 mg/（kg·h）］+静脉注射右美托咪定0.7 μg/kg，脑电图双频指数保持在40～60 间。对照组注射等量0.9%氯化钠溶液+静脉注射右美托咪定0.7 μg/kg。

1.2.2 左心室功能检测 分别记录给药前与给药后10、20、30 min 时各组的心率、左心室收缩压（left ventricular systolic pressure，LVSP）及左心室内压变化最大速率（±dp/dtmax）。

1.2.3 心肌取材 术中夹取二尖瓣置换术患者切除的少许左心室乳头肌组织，置于液氮中进行冷冻保存，在3 个月内，进行相关的分子生物学试验和病理检查。

1.2.4 β1、β2、β3 受体反转录聚合酶链反应 对心肌组织进行总mRNA 提取。取出在超低温冰箱中备好的组织，弃除冻存管后转移到经液氮预冷过的研钵中，以柞子研磨组织，在此过程中不断加入液氮，直到研至粉末状。将研磨好的样品置于己加入适量试剂的匀浆管中（100 mg 组织中加入1 mL Trizol），将匀浆管置于冰浴中，于组织匀浆粉碎机上匀浆，直至匀浆液不黏并且无颗粒。把匀浆液转移到1.5 mL 离心管中，于室温孵育5 min后，加入0.2 mL 氯仿，振荡15 s，室温孵育10 min后，4℃12 000g离心15 min。收集上层无色水相（约400 μL），置新的1.5 mL EP 离心管中，弃沉淀管。加0.5 mL 异丙醇振荡混匀，室温孵育5 min，4 ℃下12 000g离心10 min，弃上清。向管中加入1 mL 保存在4 ℃的75%乙醇（以DEPC 水配制），振荡混匀，4 ℃下10 000g离心5 min，舍弃上清。在空气中干燥5～10 min，在冰上加20 μL DEPC 水溶解RNA，-80 ℃冰箱保存。通过琼脂糖电泳检测RNA 含量。以全自动紫外分光光度计检测OD值，进而判断RNA 的纯度及浓度，并进行定量。

1.2.5 反转录合成cDNA 按反转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂说明书配制反转录反应体系，在冰上操作，最终在聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪上自动完成。将合成的cDNA 置于-20 ℃的冰箱中保存备用。反转录反应体系（20 μL）如表1 所示，反应条件如表2 所示进行实时荧光定量PCR。使用北京全式金生物技术公司合成下列相关引物，模板为cDNA，内参为β-actin。对应基因引物序列如表3 所示。

表1 cDNA 反转录体系

表2 实时荧光定量PCR 反应条件

表3 引物的核苷酸序列

1.2.6 Western blot 测定蛋白表达量 通过Western blot 试验检测CaN、活化T 细胞核因子3（nuclear factor of activated T-cells 3，NFAT3）、锌指转录因子（zinc finger transcription factor gata 4，GATA4）的表达量。取0.1 g 心肌组织，加500 μL 蛋白裂解液［RIPA，临用前加入苯甲基磺酰氟（PMSF）及磷酸酶抑制剂］，在冰浴下震荡0.5 h，将液体移至1.5 mL离心管中，在4℃冷冻离心机中12 000 r/min 离心20 min，取上清，利用BCA 蛋白法对蛋白浓度进行测定，加入适量上样缓冲液，100℃水浴加热5 min，以使蛋白变性，8 000 r/min 离心5 min 后上样，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）凝胶电泳进行分析，上样量为20～40 μL/孔，分别进行转膜与杂交。

1.3 统计学分析

本研究中数据全部采用SPSS 20.0 统计分析软件（美国IBM 公司）进行处理。计量资料采用（）表示，组间比较采用单因素方差分析或者重复测量的方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。计数资料采用［n（%）］表示，组间比较采用χ2分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者给药前后不同时间点心率比较

对照组手术前后心率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；异丙酚组患者静脉注射异泊酚后心率比对照组患者低，差异有统计学意义（P＜0.05）；异丙酚组患者给药后10、20、30 min 的心率比给药前低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 两组患者给药前后不同时间点心率比较［n=23，次/min，］

表4 两组患者给药前后不同时间点心率比较［n=23，次/min，］

2.2 两组患者给药前后不同时间点左心室收缩压比较

对照组手术前后LVSP 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；异丙酚组患者静脉注射异泊酚后LVSP 比对照组患者低，差异有统计学意义（P＜0.05）；异丙酚组患者给药后10、20、30 min 的LVSP比给药前低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。

表5 两组患者给药前后不同时间点LVSP 比较［n=23，mmHg，］

表5 两组患者给药前后不同时间点LVSP 比较［n=23，mmHg，］

注：1 mmHg=0.133 kPa

2.3 两组患者给药前后不同时间点左心室内压变化率比较

对照组手术前后左心室内压变化率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；异丙酚组患者静脉注射异泊酚后左心室内压变化率比对照组患者低，差异有统计学意义（P＜0.05）；异丙酚组患者给药后10、20、30 min 的左心室内压变化率比给药前低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表6。

表6 两组患者给药前后不同时间点左心室内压变化率比较 ［n=23，%，］

表6 两组患者给药前后不同时间点左心室内压变化率比较 ［n=23，%，］

2.4 两组患者心肌病理图片比较

心肌组织苏木素伊红染色光学显微镜结果显示，对照组患者的心肌纤维排列整齐，有明确的水平线；异丙酚组患者的心肌纤维无序，横向面肌肌丝大小不同，有些心肌细胞肥大，细胞质液泡变性，尤其在细胞核周围，肌丝粒化或网状化，间质扩大，如图1 所示。

图1 两组患者心肌组织光学显微镜下图片比较（苏木素伊红染色，×400）

2.5 两组患者反转录聚合酶链反应结果比较

与对照组患者相比，异丙酚组患者的β1 受体mRNA 表达减少、β3 受体mRNA 表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；β2 受体mRNA 表达无统计学意义（P＞0.05），详见表7。

表7 两组患者心肌组织β1、β2、β3 受体mRNA 表达结果比较 ［n=23，］

表7 两组患者心肌组织β1、β2、β3 受体mRNA 表达结果比较 ［n=23，］

2.6 两组患者心肌组织Western blot检查结果比较

与对照组患者相比，异丙酚组患者的NFAT3、GATA 表达量增加，CaN、GATA 4 磷酸化水平增加，NFAT3 磷酸化水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表8 和图2。

图2 两组患者心肌组织Western blot 测定条带比较

表8 两组患者心肌组织Western blot 检查结果比较 ［n=23，］

表8 两组患者心肌组织Western blot 检查结果比较 ［n=23，］

3 讨论

研究指出，异泊酚广泛用于麻醉的诱导和维持［12-13］，单次给药诱导时多在血压、心率、心室功能等方面出现不同程度的抑制。本研究在异泊酚给药后，分别对患者心率、心室功能等进行研究发现，对照组手术前后心率、LVSP、左心室内压变化率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；异丙酚组患者静脉注射异泊酚后心率、LVSP、左心室内压变化率比对照组患者低，差异有统计学意义（P＜0.05）；异丙酚组患者给药后10、20、30 min 的心率、LVSP、左心室内压变化率比给药前低，差异有统计学意义（P＜0.05）。心肌组织苏木素伊红染色光学显微镜结果显示，对照组患者的心肌纤维排列整齐，有明确的水平线；异丙酚组患者的心肌纤维无序，横向面肌肌丝大小不同，有些心肌细胞肥大，细胞质液泡变性，尤其在细胞核周围，肌丝粒化或网状化，间质扩大［14-15］。

β肾上腺素受体表达的变化与心肌信号通路的调节有关。在充血性心力衰竭研究中发现，随着充血性心力衰竭严重程度的升高，三种β受体亚型的表达呈现出不同的趋势，充血性心力衰竭严重程度越大，β1 受体的表达越多［16］，β2 受体的表达与充血性心力衰竭严重程度相关性不大，β3受体基因的表达与心脏功能障碍有密切关系，其中充血性心力衰竭、β心肌受体呈下降趋势［17-18］。本研究结果发现，异丙酚组患者β1 受体mRNA 表达减少，β2 受体mRNA 表达差异无统计学意义，β3 受体mRNA 表达增加。与对照组患者相比，异丙酚组患者的NFAT3、GATA 表达量增加，CaN、GATA 4 磷酸化水平增加，NFAT3 磷酸化水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。异丙酚静脉注射降低老年患者左心室功能，降低β1 受体mRNA 的表达，促进β3 受体mRNA 表达，对β2 受体mRNA表达无显著影响。β3 受体主要分布于白色及棕色脂肪组织，调节能量代谢，也介导心脏负性肌力及血管平滑肌舒张作用。本研究结果提示β3 受体表达增加可能是异丙酚静脉注射降低老年患者左心室功能的关键原因。

CaN 作为细胞内的Ca2+信号物质［19-20］，在心肌肥大中起着重要作用，有报道指出，在心肌肥大中有一种新的信号转导途径，即CaN-NFAT3（活化T 细胞因子）信号转导途径［21-22］。这项研究表明，心肌细胞在心肌肥大因子如血管紧张素的刺激下，可以通过增加Ca2+浓度，激活的CaN 使NFAT3去磷酸化并进入细胞核。入核后的去磷酸化NFAT3与转录因子GATA4 相互作用，对多种心肌肥厚的相关基因具有活化作用［23］，β1 受体表达减少与β3 受体表达的增加参与了CaN 信号通路的激活，调节充血性心力衰竭患者心肌重构的病理过程。本研究发现，与对照组患者相比，异丙酚组患者的NFAT3、GATA 表达量增加，CaN、GATA 4磷酸化水平增加，NFAT3 磷酸化水平降低。

综上所述，异丙酚静脉注射降低老年患者左心室功能，降低β1 受体mRNA 的表达，促进β3 受体mRNA 表达，对β2 受体mRNA 表达无显著影响。