B淋巴细胞瘤-xL蛋白及其在肿瘤耐药中作用机制的研究进展〔1〕

杨伟锋，李晓宁，李军岐，许书君，王菁婧，张晨静

(1.山西医科大学第一临床医学院，山西 太原 030001；2.山西医科大学，山西 太原 030001)

临床上治疗肿瘤的三种手段是手术、放疗和化疗，只有化疗是全身治疗手段，但耐药性极大地影响了化疗药物的疗效。研究[1]显示，B淋巴细胞瘤-XL蛋白(Bcl-xL)是肿瘤耐药机制中的一个重要靶点，尤其是它在肿瘤细胞中的过表达与肿瘤耐药密切相关，且在结直肠癌、膀胱癌、白血病、卵巢癌及宫颈癌等肿瘤中都得到证实。因此认识Bcl-xL蛋白并探究其在肿瘤耐药中的作用机制对未来肿瘤研究的发展至关重要。本文就目前Bcl-xL蛋白的研究进展，从其分子结构、生物功能、调节机制以及在肿瘤耐药中的作用机制等方面进行阐述，为今后肿瘤耐药机制的研究提供理论基础。

1 B淋巴细胞瘤-XL蛋白

1.1 Bcl-xL蛋白的结构

B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)家族蛋白是调控细胞凋亡的重要蛋白。1984年Bcl-2基因在人类的B细胞淋巴瘤细胞异位染色体t(14，18)上首次克隆产生，从此打开Bcl-2家族蛋白的探索之门。截至目前，已经发现了25种Bcl-2同源蛋白。根据其结构和功能主要分为三类：第一类具有抗凋亡的作用，包括Bcl-2，Bcl-w，Bcl-xL等；第二类具有促凋亡作用，包括Bax，Bak等；第三类只有BH3结构域，称为BH3-only，同样具有促进细胞凋亡的作用。Bcl-xL是Bcl-2家族中第一个阐明空间结构域的蛋白，它是利用X射线晶体衍射与核磁共振分光术相结合的方式获得的，促进了Bcl-2家族中其他蛋白结构的研究。Bcl-xL是一种由233个氨基酸组成的蛋白质，其所包含的结构域与Bcl-2相似。它是由一条长度可变的环形结构连接8个α螺旋构成，含有与Bcl-2同源的结构域—BH1，BH2，BH3和BH4，其中BH4，BH3结构域分别与α螺旋1、α螺旋2相对应，BH1结构域与α螺旋5以及与其相连的环形结构相对应，BH2与α螺旋6及其下游的结构域相对应。在Bcl-xL蛋白中有一个疏水环，它的顶部由BH1，BH2，BH3三个结构域构成，底部由α螺旋3和α螺旋4构成。这个疏水环可以与Bcl-2家族中部分促凋亡蛋白上相应的结构结合形成一个异源二聚体，从而发挥Bcl-xL的抗凋亡作用[1]。正常情况下，合成的Bcl-xL散布在胞质中，只有接受细胞凋亡信号时，它才会迅速转移到线粒体膜表面发挥作用。Bcl-xL作为细胞中抗凋亡的主要作用因子，还有其他重要作用，例如在对成年小鼠研究中发现，Bcl-xL蛋白对辐射引起的肾脏损害所致的贫血具有保护作用[2]；其次还发现Bcl-xL蛋白可通过对神经生长和突触可塑性的调节、对Ca2+信号传递的调节来促进ATP合成和提高代谢效率；另外其在自身免疫性疾病与衰老过程中也发挥重要作用[3]。

1.2 Bcl-xL蛋白的功能及其调控机制

Bcl-xL最主要的作用为抑制细胞凋亡，其在肿瘤发展中发挥重要作用[4]。细胞凋亡是指机体为维持内环境的稳定而通过一系列基因调控细胞死亡的过程。细胞凋亡主要有三种途径，分别是死亡受体凋亡途径、线粒体途径以及内质网途径。Bcl-xL主要通过线粒体途径发挥其抗凋亡作用。在线粒体凋亡途径中，当接收到细胞凋亡信号时，线粒体在各种因子作用下发生线粒体膜通透性改变，使线粒体转运孔开放、跨膜电位降低，引起凋亡启动因子细胞色素c和凋亡诱导因子释放，激活半胱氨酸蛋白酶级联反应，使DNA分子断裂产生凋亡小体，最终导致细胞凋亡。在这一个过程中Bcl-xL蛋白迅速聚集到线粒体外膜，通过疏水环与促凋亡蛋白Bax的BH3结构域之间的特异性结合来抑制线粒体外膜通透性改变，从而阻止线粒体凋亡途径的进行，进而发挥抗凋亡作用[5]。由此可见，调控细胞凋亡的关键点在于Bcl-xL蛋白的产生。目前已知Bcl-xL蛋白是人类第20号染色体上的Bcl-xL基因通过选择性剪接产生的蛋白质。细胞凋亡在转录水平的调节，主要是通过一系列的转录因子对Bcl-xL基因表达进行调控，从而影响Bcl-xL蛋白的产生。研究[6]显示，在人的成骨细胞中表达一种转录因子即GATA-DNA结合蛋白(GTA-3)，可以调节Bcl-xL基因表达的反式激活活性来影响骨折的愈合。在大肠癌的研究中发现，长链非编码RNA HEIH(lncRNA-HEIH)可以破坏miR-939与核因子κb(NF-κb)的结合，导致NF-κb与Bcl-xL启动子的结合增加，最终促进Bcl-xL基因的转录和表达[7]。另外，研究[8]发现核转录因子(Nrf2)可以与细胞保护基因启动子区的抗氧化反应元件(ARE)结合，增强其表达；过表达的Nrf2可以增强抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达，从而增强细胞的耐药性[8]。

目前已知Bcl-xL蛋白的降解主要通过泛素化蛋白酶体系统来调节。在泛素化蛋白酶体系统中最重要的酶是E3泛素连接酶，它决定了泛素化对底物的选择性和特异性[9]。跨膜泛素连接酶RNF-183是一个含有典型C3HC4环指结构的蛋白，在哺乳动物的细胞系中很常见。该蛋白主要定位在内质网的膜整合蛋白，具有E3泛素连接酶的活性，它可以多聚泛素化修饰Bcl-xL，促使Bcl-xL蛋白的降解[10]。在对结直肠癌细胞的研究中发现，特异性激活蛋白酶活化受体2(PAR2)可以显著上调Bcl-xL蛋白的表达，同时还发现Bcl-xL蛋白的半衰期延长。研究[11]表明，激活PAR2信号通路能够增加促凋亡蛋白Bad的磷酸化，同时增加抗凋亡蛋白Mcl-1表达的磷酸化，而Bad与Mcl-1都属于Bcl-2蛋白家族。所以在敲除结直肠癌细胞中PAR2基因后，我们发现E3泛素连接酶RNF152的表达显著增加，同时发现过表达的RNF152可明显降低Bcl-xL蛋白的表达水平。免疫共沉淀实验发现RNF152可以与Bcl-xL蛋白相互作用，且活化的PAR2可以降低RNF152与Bcl-xL蛋白之间的相互作用。由此表明，PAR2可能通过抑制Bcl-xL蛋白的泛素化降解而促进Bcl-xL蛋白在结直肠癌细胞中的高表达，证实在结直肠癌细胞中过表达的Bcl-xL蛋白可能受PAR2的调控，从而影响其耐药性[12]。研究[13]发现维甲酸-干扰素诱导的死亡相关基因GRIM19在对顺铂产生耐药性的晚期膀胱癌细胞中的过表达可以促进Bcl-xL蛋白的泛素化，并推断该泛素化过程可能以P38/JNK依赖的方式进行，且已证实可以降低癌细胞中Bcl-xL蛋白的表达，降低膀胱癌细胞对顺铂的耐药性。研究[14]发现跨膜E3泛素连接酶RNF183能以泛素化依赖的方式降解抗凋亡蛋白Bcl-xL。由此可见，泛素-蛋白酶体系统介导的Bcl-xL蛋白的降解可能为Bcl-xL高表达导致的肿瘤耐药提供了新的治疗靶点。

此外，肿瘤抑制因子p73在胞浆中通过其反式激活结构域(TAD)与Bcl-xL中一个非经典位点结合，影响Bcl-xL的修饰识别模式，从而诱导细胞以线粒体途径凋亡[13]。

2 Bcl-xL与肿瘤耐药

目前研究表明肿瘤化疗失败的主要原因是肿瘤耐药[14]。肿瘤产生耐药的原因多种多样，包括耐药相关蛋白的异常表达、DNA损伤和修复功能障碍、细胞自噬以及细胞的凋亡机制异常等[15]。化疗药物杀死肿瘤细胞的主要机制就是通过各种途径诱导细胞凋亡。近年不断有研究者发现[16]，抗凋亡蛋白Bcl-xL在多种耐药肿瘤细胞中都有过表达的现象。在小细胞癌、膀胱癌、黑色素瘤以及急性髓系白细胞病(AML)，尤其是化疗耐药的AML中，都发现了抗凋亡蛋白Bcl-xL过表达的现象。研究[17]显示通过人工调节Bcl-xL蛋白在胶质细胞瘤干细胞中的表达发现，Bcl-xL蛋白的表达与肿瘤的大小具有相关性，此外通过上调Bcl-xL蛋白的表达发现，胶质母细胞瘤对BH3模拟物敏感。对于过表达的Bcl-xL蛋白是如何影响肿瘤耐药的?研究发现在不同的肿瘤中其作用机制也不相同。在恶性外周神经鞘瘤(MPNST)细胞研究中发现，NF1基因表达下调时，Bcl-xL蛋白高表达可导致细胞对抗癌药物产生耐药性，表明Bcl-xL蛋白的过表达与MPNST细胞的耐药性产生相关[18]。研究[19]发现转录因子1 (WT1)与急性髓系白血病细胞系中Bcl-xL表达密切相关，可以直接与Bcl-xL基因的启动子结合反式激活Bcl-xL基因表达，而Bcl-xL蛋白的过表达可以使AML细胞对抗癌药物的耐药性增加。王彩梅和李海香[20]研究宫颈癌细胞时发现，Bcl-xL蛋白的表达水平随miR-417的表达降低而降低。通过流式细胞术检测发现，Bcl-xL蛋白在该类细胞中过表达可以逆转由miR-417下调引起的细胞凋亡，使细胞对化疗药物产生耐药性[20]。研究[21]显示在尿路上皮癌细胞中，三氟拉嗪(一种抗精神药物)可以通过抑制Bcl-xL蛋白的表达使其对顺铂的耐药性降低，说明尿路上皮癌细胞的耐药性与Bcl-xL蛋白的表达具有相关性。除此之外，我们课题组前期预实验结果显示，Bcl-xL蛋白的高表达与卵巢癌的耐药性相关。综上所述，不同肿瘤细胞对抗癌药物产生耐药性与Bcl-xL蛋白的过表达密切相关，但是其中具体的作用机制有待进一步研究。

3 Bcl-xL蛋白拮抗剂

虽然Bcl-xL蛋白在肿瘤耐药中的具体作用机制还不是很明了，但不少研究者已将Bcl-xL蛋白作为肿瘤耐药治疗的突破口。研究表明，BH3结构域是Bcl-xL蛋白发挥抗凋亡功能的必要结构，因此针对BH3结构域设计与其具有较高亲和力和选择性的活性小分子已成为当下癌症药物研究的热点[22]。目前对Bcl-xL蛋白拮抗剂分子骨架的研究较多，主要有以下三种：第一，由Ryan等[23]运用全新药物设计方法研究的具有苯甲酰脲骨架的Bcl-xL拮抗剂，具有很强的靶向性；第二，Tao等[24]研究证明，含有苯丙噻唑骨架的Bcl-xL蛋白拮抗剂，对慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤有一定的疗效；第三，以磺酰胺为核心骨架的Bcl-xL蛋白拮抗剂，是目前达到摩尔水平的小分子抑制剂。这三种分子骨架是目前Bcl-xL蛋白拮抗剂研究的三个不同方向，相信随着研究的深入，将会开发出更多的Bcl-xL蛋白拮抗剂。

4 结 语

肿瘤耐药是一个极其复杂的过程。Bcl-xL蛋白作为肿瘤耐药机制中的一个重要靶点，深入研究其在肿瘤耐药中的作用机制，对增强化疗药物的疗效有很大的帮助。目前虽已进行了大量研究，但依旧处于质变前的量变积累阶段，大多数对肿瘤耐药中Bcl-xL蛋白作用机制的研究只是证明了某种影响因子与Bcl-xL蛋白之间存在相互作用，对于二者之间是如何相互作用的研究很少。因此，更加深入地研究各种影响因子与Bcl-xL蛋白之间的相互作用，阐明Bcl-xL蛋白的作用机制对解决肿瘤耐药问题至关重要。