子宫内膜基质细胞AQP7的表达以及卵巢激素对AQP7的调控作用#

刘敏 米永杰 刘洪 陈登榜 代吕霞 代娟 李飞燕 何煦 张丹

（1. 成都医学院临床医学国家级实验教学示范中心，四川 成都 610500；2. 成都医学院检验医学院，四川 成都 610500；3. 成都中医药大学医学与生命科学学院影像教研室，四川 成都 610016.）

据报道，全世界大约75%的早期妊娠失败源于胚胎植入的异常[1,2]。尽管体外受精和胚胎移植技术在治疗不孕不育有较大进展，但是胚胎植入率仍然不理想[3]。

研究胚胎早期发育和胚胎着床有助于解决这一难题。然而对于人类胚胎着床研究由于受到伦理的限制，因而该领域的研究主要在实验动物模型，特别是小鼠中进行。小鼠囊胚黏附于子宫内膜上皮后，围绕囊胚周围的基质细胞快速增殖与分化，从而促使囊胚完全植入子宫内膜，该过程称为蜕膜化，蜕膜化是早期妊娠的重要过程[4,5]。

分布于细胞膜的水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是一种六次跨膜蛋白，AQPs通过介导水转运来维持内环境的平衡。在已发现的16种AQPs (AQP0-AQP14,16) 中，第二类为甘油水通道蛋白，这类AQPs可以介导甘油等的跨膜转运[6]，AQP7属于甘油水通道蛋白。

研究发现，在肠上皮和皮肤肿瘤的发生等细胞增殖速度快的组织中，甘油水通道蛋白跨膜转运的甘油通过代谢为这些组织提供细胞增殖所需要的能量[7,8]。而子宫内膜蜕膜化过程与肿瘤局部能量代谢相似，子宫蜕膜细胞的增殖和分化需要大量的能量供应，因此我们推测AQP7参与了小鼠子宫蜕膜化的发生。

我们采用孕小鼠模型，分离原代小鼠子宫内膜基质细胞建立体外蜕膜化模型，研究AQP7在小鼠子宫内膜中的表达情况，AQP7在体外诱导蜕膜化模型中的表达，以及卵巢激素对AQP7的调节作用，以探讨AQP7在子宫基质细胞蜕膜化中的作用。

1 材料与方法

1.1 构建孕小鼠模型

实验所用ICR小鼠（7～9周周龄）均购于成都达硕实验动物股份有限公司。雌性与雄性小鼠按2：1比例合笼。本研究通过成都医学院医学伦理委员会批准，操作符合关于善待实验动物指导性意见的要求。

1.2 小鼠原代子宫内膜基质细胞（ESCs）分离培养及体外诱导蜕膜化模型的建立

将25 g·L-1的胰酶和6g/l的分散酶加入至孕小鼠子宫组织块中，置4℃孵育60 min，室温30 min；使用含1%胎牛血清的D-Hank’s 液终止消化，收集沉降组织。加入0.05%的胶原酶I消化组织块，37℃孵育20 min；在沉积组织中加入PBS 液，收集上清液，1500 rpm离心5分钟，沉淀即为基质细胞。

基质细胞用DMEM/F12培养基重悬，在37℃、5% CO2培养箱中培养；细胞贴壁后，加入10-6M 醋酸甲羟孕酮 和 10-8M 17β-雌二醇以体外诱导基质细胞蜕膜化。

1.3 采用RT-qPCR 检测子宫内膜蜕膜细胞中AQP7、 prl8a2的mRNA表达

使用Trizol试剂提取细胞的总RNA，按照反转录试剂盒中的实验步骤构建逆转录体系，获得cDNA产物；扩增反应在荧光定量PCR 仪（型号PIKORed 96，ThermoFisher仪器有限公司，美国）上进行，反应结束后，采用MUS β-actin作为内参基因，利用SDS软件进行数据分析。

所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成，并以ULTRAPAGE纯化：AQP7 上游引物5'-3' GCTTGGTCTGCTGCTTCAG，下游引物5'-3' GGGGTTCGAGTGATGCATTT；Prl8a2 上游引物 5'-3' AGCCAGAAATCACTGCCACT，下游引物5'-3' TGATCCATGCACCCATAAAA；MUSβ-actin 上游引物5'-3' TCAGGAGGAGCAATGATCTTG，下游引物5'-3' TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA。

1.4 免疫组织化学染色

收集孕小鼠子宫，石蜡包埋切片，将脱蜡后的切片加入3%双氧水置室温10min，PBS洗3次；高温抗原修复切片后冷却至室温，滴加山羊血清以封闭非特异性结合位点；滴加一抗（兔抗小鼠AQP7多克隆抗体1:200，Proteintech，美国），4℃过夜；滴加生物素化二抗IgG工作液，37℃ 30 min；二氨基联苯氨液染色后采用苏木素轻度复染，显微镜下观察AQP7在子宫内膜的分布特点。

1.5 细胞体外激素处理

将体外培养的子宫基质细胞进行分组，分别加入含有雌二醇 E2（10 nM），孕酮P4（1μM）以及E2（10n M）和P4（1μM）的DMEM/F12 培养基，处理24小时后收集细胞。

用E2的拮抗剂ICI 182,780（1μM）和 P4的拮抗剂RU486（1μM）预处理基质细胞2小时后，再用E2和P4处理24小时后收集细胞进行检测。

1.6 统计学分析

实验样品均一式三份，每项实验至少重复检测三次。实验数据用均值±标准差表示。采用SPSS20.0软件分析数据。采用独立样本t检验比较两组间差异，在比较两个以上样本间时，以单因素方差分析组间差异。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AQP7在小鼠子宫内膜基质细胞中表达具有明显的时空特点

体外分离孕4～8天小鼠子宫基质细胞，采用RT-PCR检测基质细胞AQP7 mRNA的表达情况。检测结果如图1A所示，AQP7 mRNA在孕4～8天的子宫内膜基质细胞中的表达逐渐升高。

收集孕4～8天小鼠子宫，采用免疫组化染色检测AQP7蛋白在子宫内膜组织的表达，结果（图1B、图1C）显示，在孕第4天的着床窗口时期，子宫内膜基质细胞几乎不表达AQP7。

图1 AQP7在孕早期小鼠子宫内膜上皮的表达

随着孕激素分泌增加，在孕第5天，AQP7主要表达于子宫内膜着床胚胎周围的初级蜕膜区（PDZ）基质细胞中。在孕第6天和孕第7天，随着孕激素进一步分泌和基质细胞蜕膜化进程，子宫内膜蜕膜化的基质细胞中AQP7的表达明显增多，免疫组化染色呈强阳性。

而孕第8天，子宫内膜次级蜕膜区SDZ蜕膜细胞中，AQP7的表达有所减弱。从孕第5天到第8天，随着蜕膜化的进程，子宫内膜基质细胞中AQP7表达模式表明雌、孕激素可以调节AQP7蛋白的表达。

2.2 在体外诱导蜕膜化模型中AQP7在蜕膜细胞中的表达

分别于0 h、48 h、72 h和96 h，在体外分离培养的小鼠基质细胞中加入10-6M 醋酸甲羟孕酮 和 10-8M 17β-雌二醇以诱导基质细胞蜕膜化，以建立体外诱导蜕膜化模型。

通过RT-PCR检测小鼠蜕膜标记物Prl8a2 mRNA在基质细胞中的表达、以判断基质细胞蜕膜化的情况。

研究结果发现，在诱导蜕膜化后72 h和96 h小鼠基质细胞中Prl8a2 mRNA表达显著升高，以96 h时基质细胞中Prl8a2 mRNA升高尤为明显（图2A），提示体外诱导蜕膜化模型建立。

随后采用RT-PCR检测在诱导蜕膜化不同时间点、基质细胞中AQP7 mRNA的表达情况，结果发现，在诱导蜕膜化后72 h和96h小鼠基质细胞中AQP7 mRNA表达显著升高，以96 h时基质细胞中AQP7 mRNA升高尤为显著（图2B）。

图2 体外诱导蜕膜化模型中蜕膜细胞AQP7的表达

2.3 卵巢E2和P4上调基质细胞AQP7表达

将分离侧小鼠孕5天的基质细胞进行体外培养，待细胞贴壁后分为：① E2组，分别在6小时、12小时和24小时加入0.01μmol•L-1E2； ② P4组，分别在6小时、12小时和24小时加入1 μmol•L-1P4； ③E2和P4联合处理组，分别在6小时、12小时和24小时加入0.01μmol•L-1E2和1μmol•L-1P4。④用ER拮抗剂ICI 182,780（1 μM）和PR拮抗剂RU486（1 μM）预处理基质细胞 2 小时后，再用E2和P4处理24小时。在不同时间点收集细胞，RT-PCR检测卵巢激素对基质细胞AQP7的调控。结果发现，与对照组比较，E2组在不同的时间点、单独加入E2后基质细胞AQP7表达无明显变化（图3A）。而P4组在不同的时间点、单独加入P4后，基质细胞AQP7表达也无明显变化（图3B）。而与对照组比较，E2+P4组在E2和P4联合作用6小时基质细胞AQP7表达无明显改变，作用12小时后基质细胞AQP7表达开始升高（图3C），作用24小时后基质细胞AQP7表达进一步显著升高（图3C），这表明E2和4P联合作用可上调基质细胞AQP7表达；且在E2和P4联合作用24小时后，基质细胞AQP7表达的升高能够被拮抗剂ICI 182,780和拮抗剂RU486阻断（图3D）。

图3 体外激素模型中卵巢激素对基质细胞AQP表达的调控

3 讨论

水通道蛋白（AQPs）是跨膜通道蛋白。到目前为止，至少发现12种AQPs在哺乳动物的不同组织中有表达[9,10]。有关AQP7在子宫中的表达也有报道[11]。在体外培养的小鼠子宫内膜上皮细胞中检测发现AQP7的表达显著升高。Tanski D等研究中发现AQP7在猪的子宫内膜腔上皮细胞中显著升高[12]。彭在对孕小鼠进行检测时，发现AQP7在子宫蜕膜组织中的表达显著升高[13]。AQP7属于甘油水通道蛋白中，甘油水通道蛋白可以介导甘油转运，甘油被证明是细胞增殖的替代能源，特别是在高代谢的组织中更为明显[14]，这在哺乳动物的生殖过程中起到了关键的作用[6]。

我们在研究中发现，孕早期小鼠子宫基质细胞AQP7呈高表达，主要表达于子宫内膜初级蜕膜区和次级蜕膜区。这些结果与彭的研究一致[13]。并且我们发现AQP7的表达模式与蜕膜化进程密切相关，随着蜕膜化的发展，AQP7的表达越显著，表达范围也更加广泛，这表明雌、孕激素可以调节AQP7蛋白的表达。

AQP7在小鼠围绕胚胎着床部位的蜕膜细胞中高表达的模式表明其在蜕膜化和胚胎着床中发挥了重要作用。随后，我们分离小鼠子宫内膜原代基质细胞建立了体外诱导蜕膜化模型。在体外诱导的蜕膜细胞中AQP7同样特异性地高表达。彭等进一步研究发现在围植入期，子宫中甘油含量和甘油激酶表达也随蜕膜化进程逐渐增加[13]。AQP7表达与子宫中甘油积累、甘油激酶表达协同增高的特异表达，因而认为甘油可能是小鼠子宫蜕膜化过程中必要的能量物质，AQP7很可能通过介导甘油转运而参与基质细胞向蜕膜细胞的转化[13]。

为进一步探究雌、孕激素对子宫基质细胞AQP7表达的影响，我们在体外培养的孕小鼠的基质细胞中加入E2和P4，采用 RT-PCR检测卵巢激素对基质细胞AQP7的调控。结果发现，单独加入E2以及P4后、基质细胞AQP7表达无明显变化，表明雌激素和孕激素单独作用对基质细胞AQP7表达无明显调控作用。而E2和P4联合组在E2和P4联合作用后，基质细胞AQP7表达显著升高，这表明E2和P4激素的联合作用可上调基质细胞AQP7的表达。并且我们进一步研究发现，E2和P4联合调控的基质细胞AQP7的升高能够被雌激素受体的拮抗剂ICI182,780和孕激素受体的拮抗剂RU486阻断，这提示雌二醇和孕酮可以通过其类固醇激素受体调控AQP7的表达。AQPs的表达可能受到各种调控因素的影响，除了雌、孕激素外，还可能受到细胞因子、激活信号等的作用。 Tanski, D等分离猪的子宫内膜腔上皮细胞并体外培养，结果发现E2 联合 H89（PKA抑制剂）、E2 联合 PD98059（MAPK抑制剂）、P4联合PD98059可以促使内膜腔上皮细胞AQP7的表达增加[12]。这表明在排卵期，猪的子宫内膜上皮细胞AQP7的表达可能由雌二醇、孕酮通过PKA信号或者MAPK信号途径调控，然而调控AQP7表达的机制还不清楚。

随着蜕膜化的进程，在孕早期小鼠子宫内膜基质细胞AQP7表达逐渐增加。在体外诱导的蜕膜细胞中AQP7同样特异性地高表达。卵巢雌二醇和孕酮联合作用可上调子宫基质细胞AQP7表达。AQP7在小鼠围绕胚胎着床部位蜕膜细胞的高表达模式，表明其在蜕膜化和孕早期胚胎着床中发挥着重要作用。而AQP7在蜕膜化中作用机制尚不清楚，需要在后续的实验中进一步地探索。