养水机对刺参池塘理化参数和细菌丰度的影响

张东升 ，王祖峰，周 玮

（1. 大连海洋大学水产与生命学院，辽宁 大连 116023； 2. 大连海洋大学/农业农村部北方海水增养殖重点实验室，辽宁 大连 116023； 3. 全国水产技术推广总站/中国水产学会，北京 100125）

刺参 (Apostichopus japonicus) 已成为中国北方地区重要的海水养殖品种[1]。由于长期单一品种养殖，池塘底部有机物大量沉积，在水体分层池塘底部缺氧时，厌氧发酵产生大量有毒有害物质，如硫化氢 (H2S)、总氨氮 (TAN)、致病菌等，导致刺参患病，甚至死亡[1]。为提高池塘环境质量，生产上常采用清淤和底改剂或微生态制剂方式消除底质带来的不良反应。由于刺参养殖池塘底部铺设礁石，清淤施工困难且成本较高，目前此方法已较少使用；底改剂通常是一些化学药剂，如四羟甲基硫酸磷 (THPS) 等，消除沉积物产生的TAN等物质速度快，但不能从根本上降低沉积物中有机质 (TOM)含量，且会造成池塘微生态失衡和药物残留，影响刺参品质[2-5]；微生态制剂效果缓慢，且目前在刺参池塘使用的微生态制剂多为陆源或其他水产养殖品池塘分离的菌种，效果有时不理想，泼洒适合的微生态制剂能够较好改善池塘水质[6-7]，但有关泼洒微生态制剂对池塘底质改善效果的报道较少[8]。

为解决刺参池塘底部缺氧问题，养殖生产中普遍使用微孔曝气装置[9-10]，该装置的使用缓解了夏、秋高温季节刺参池塘缺氧状况，改善了水质，但其动力大，长时间运转费用较高且通气孔易堵塞[10]，不能消除水体分层和抑制大型藻类生长；而鱼塘常用的增氧机搅动较大，造成池塘水混浊，也不适合刺参生长要求，因此催生了一种新型水质调控仪——养水机[11-13]。养水机除能提高池塘溶解氧外，最重要的是能减少温、盐跃层存在时间[11-13]、抑制大型藻类生长[14]，可使刺参成活率提高42.5%以上，单产提高30%以上，产量达2 250 kg·hm-2以上[11]，是刺参绿色健康养殖水质调控的一种新设备。继王祖峰[11]试验后，本研究以微孔曝气和自然纳潮池塘为对照，测定了养水机对刺参池塘水中藻类[14]、水体初级生产力[15]、沉积物酶[16]和耗氧率的影响[17]，以全面科学评价养水机控水效能；并分析了养水机对池塘活的异养菌和可培养弧菌以及水体理化因子的周年影响，以为养水机的下一步研究和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 养水机构造和运行机理

养水机是一种针对刺参生长特点、能打破池塘水体温、盐跃层的新型水质调控设备 (图1)。该设备结合物理和生物水质调控技术，在实际应用中表现出肥水、抑草、活水、节能等多方面优点[11,14-17]。养水机主要分为进水组件、生物包、水循环动力装置和水输出喷头4个部分。养水机在工作时，通过水循环动力装置抽取表层溶解氧 (DO)丰富的水进入进水口，再流入生物包进行过滤，最后由位于池塘底部的出水喷头将水朝向与养水机位置相对的池塘方向喷射出去，实现池塘水在垂直方向快速交换，打破温、盐跃层造成的池塘底部缺氧问题。

图1 养水机结构模拟图Figure 1 Structure simulation diagram of Jet Water Mixer

1.2 试验池塘及刺参养殖管理

本试验在大连庄河宝发海珍品有限公司刺参养殖池塘进行，所选池塘长约600 m、宽85 m、水深1.2～2.0 m，选择9口大小、形状一致的相邻池塘进行试验。

试验设置3组，每组重复3次。养水机试验组，在池塘最深处放置一台功率为750 W的养水机，春、夏、秋季每日21:00—次日09:00连续工作 12 h (9 kW·h·d-1)，冬季 (12、1、2 月) 工作 1 h；微孔曝气对照组，在池塘底部铺设1套微孔曝气系统，由空压机 (1.5 kW·hm-2，用电量至少15.2 kW·h·d-1)、总供气管和微孔曝气盘组成，池塘缺氧时开始工作 (这是微孔曝气装置标准使用方法)；自然纳潮对照组，除了与养水机和微孔曝气池塘在每月大潮期间同时更换池塘水外，无其他调水装置。试验期间，各池塘放养的刺参规格(2.5 g·尾-1)、密度 (15 尾·m-2) 相同，不投饵、不投药，统一管理 (包括所有池塘均使用微生态制剂的时间和剂量等)。

1.3 水样和沉积物样品采集

2015年10月—2016年9月，每月于大潮前3～5 d的上午采集水样1次，采用5 L颠倒式采水器采集各池塘进水口、出水口、中心位点的表层(距水面约5 cm)、中层、底层水 (距池底约5 cm)，然后各点各层水样在现场等量混合后带回实验室。在相同采水位点使用圆柱形采泥器 (横截面直径5 cm) 采集表层0～10 cm的样品5次，取采集沉积物样品的中心部位混合后放于无菌自封袋中，带回实验室后根据需要进行处理 (所有水样和沉积物都在采集后1 h内带回实验室)。

1.4 池塘水质理化参数测定

在各个采样点，使用YSI多参数水质分析仪(Professional plus，美国) 即时测定水体的各层水温、盐度、DO、pH。将采回的混合水样，分别采用GB/T 12763.4—2007中的次溴酸盐氧化法、萘乙二胺分光光度法、磷钼蓝分光光度法立即测定TAN、亚硝态氮 (NO2--N)、活性磷酸盐 (PO43--P)含量。

1.5 池塘沉积物中TOM含量测定

采用灼烧法[18]，将带回实验室的沉积物取出一部分放于培养皿中，于105 ℃干燥箱中烘干至恒质量后，称质量 (Mo)，然后在550 ℃下灼烧6 h后称质量 (Mt)，沉积物中TOM质量分数 (a) 按下式计算：

1.6 活的异养菌、可培养弧菌数量的测定

采用活菌直接计数法 (Direct count of viable bacterial cells, DVC)[19]计数活的异养菌数量，使用TCBS培养基，采用常规平板涂布法，接种原始和10-1稀释水样，以及10-1和10-2沉积物稀释上清液，在25 ℃下培养7 d后计数。活的异养菌和可培养弧菌的最终丰度以“平均值±标准差 (±SD)”表示。

1.7 数据处理

使用Excel 2016软件进行绘图分析，使用SPSS 19.0软件对各种测定数据进行平均值和方差分析，对不同池塘同一因子平均数采用Tukey法进行多重比较；方差分析显著性水平设为0.05。

2 结果

2.1 养水机对池塘理化因子的影响

池塘理化因子年变化趋势见图2、图3、图4。不同水质调控方式基本未改变水质的年变化趋势。

全年水温、盐度、pH分别介于-2.1～27.5 ℃、29.9～36.3、7.3～8.6 (图 2)，相同月份各池塘之间盐度差异均不显著，但个别月份各池塘之间温度和pH差异显著 (P＜0.05)，其中3月养水机池塘比自然纳潮和微孔曝气池塘分别提高2.4和3.6 ℃ (P＜0.05)，2月比自然纳潮池塘提高1.9 ℃ (P＜0.05)。

图2 池塘水温、溶解氧、pH和盐度年变化各图每月数据方柱上小写字母不同，代表各池塘之间在该月份该指标差异显著 (P＜0.05)；图3、图5同此。Figure 2 Annual variation of temperature, dissolved oxygen, pH and salinity in pond waterDifferent lowercase letters on the data represent significant difference of the same index between different ponds in the same month (P＜0.05). The same case in Figure 3 and Figure 5.

养水机、微孔曝气、自然纳潮池塘水中DO分别介于 4.7～13.6 mg·L-1、4.4～13.9 mg·L-1、4.2～13.2 mg·L-1，年均值分别为 (8.32±0.19)、(8.22±0.23)、(7.66±0.30) mg·L-1，养水机和微孔曝气池塘DO年均值差异不显著但均显著高于自然纳潮池塘 (P＜0.05，表1)。与自然纳潮池塘相比，养水机池塘DO除了3、4、5月略低以外，其余月均较高(其中1、2、6月显著，P＜0.05)；与微孔曝气池塘相比，养水机池塘DO在夏季6—8月和冬季1、12月及秋季10月较高 (其中6、12月显著，P＜0.05)，其余月略低，致使养水机池塘DO的年均值与微孔曝气池塘相近，但养水机能提高夏季和冬季池塘DO，有利于刺参存活及夏季池塘底部TOM降解。

养水机、微孔曝气、自然纳潮池塘水中TAN月质量浓度分别介于 0.034～0.375 mg·L-1、0.058～0.388 mg·L-1、0.107～0.430 mg·L-1(图 3)，年均值分别为 (0.208±0.005)、(0.228±0.019)、(0.238±0.008) mg·L-1，养水机池塘年均值最低，其次是微孔曝气池塘，自然纳潮池塘最高，养水机池塘显著低于对照池塘 (P＜0.05)，对照池塘之间差异不显著。3—11月，尽管养水机池塘与对照池塘水中TAN浓度在某些月份差异不显著，但月浓度均最低，说明养水机在春、夏、秋季降低TAN效果良好。

养水机、微孔曝气、自然纳潮池塘水中的NO2--N月质量浓度分别介于 (0.000～19.000)×10-3mg·L-1、(0.000～23.000)×10-3mg·L-1、(1.000～25.000)×10-3mg·L-1(图 3)，年均值分别为 (4.795±0.068)×10-3、(6.077±0.167)×10-3、(7.308±0.196)×10-3mg·L-1(表 1)。养水机池塘 NO2--N 各月质量浓度 (除6和11月外) 和年均值均最低，自然纳潮池塘 (除4和11月外) 均最高，各池塘年均值之间差异显著 (P＜0.05)；与微孔曝气池塘相比，除了6月养水机池塘略高外，其他月份均较低 (其中4、7、8月显著低于微孔曝气池塘，P＜0.05)，说明养水机去除水中NO2--N效果良好，尤其在3—11月更加显著。

图3 池塘水总氨氮、亚硝态氮和活性磷酸盐质量浓度周年变化Figure 3 Annual change of contents of TAN, -N and-P in pond water

养水机、微孔曝气、自然纳潮池塘沉积物TOM月质量分数分别为0.75%～1.03%、0.93%～1.23%、1.02%～1.43% (图 4)，年均值分别为 (0.840±0.021)%、(1.024±0.046)%、(1.198±0.053)% (表 1)，月均值和年均值养水机池塘最低，其次是微孔曝气池塘，自然纳潮池塘最高。各池塘沉积物TOM含量差异显著 (P＜0.05)，说明养水机运转1年后，始终维持池塘沉积物中较低的TOM含量。

表1 各池塘水质理化因子年均值Table 1 Annual means of physicochemical parameters in each pond ±SD

表1 各池塘水质理化因子年均值Table 1 Annual means of physicochemical parameters in each pond ±SD

注：同列不同上标字母代表差异显著 (P＜0.05)，表2同此。Note: Different superscript letters within same column indicate significant difference (P＜0.05). The same case in Table 2.

有机质质量分数TOM/%养水机 JWM 8.32±0.19a 0.208±0.005a 4.495±0.068a 0.025±0.001a 0.840±0.021a微孔曝气 SA 8.22±0.23a 0.228±0.019b 6.077±0.167b 0.025±0.002a 1.024±0.046b自然纳潮 Control 7.66±0.30b 0.238±0.008b 7.308±0.196c 0.020±0.002b 1.198±0.053c池塘Pond溶解氧DO/(mg·L-1)总氨氮TAN/(mg·L-1)亚硝态氮NO-2 -N/(10-3 mg·L-1)活性磷酸盐PO3 4 --P/(mg·L-1)

图4 池塘沉积物有机质质量分数周年变化相同时间不同小写字母代表差异显著。Figure 4 Annual change of sediment organic matter content in pond sedimentDifferent lowercase letters at the same time represent significant difference.

2.2 养水机对池塘活的异养菌和可培养弧菌丰度的影响

各池塘水和沉积物中活的异养菌和可培养弧菌丰度周年变化见图5。养水机、微孔曝气、自然纳潮池塘水中活的异养菌丰度分别介于8.967×105～1.773×107个·mL-1、6.500×105～1.915×107个·mL-1、6.817×105～1.682×107个·mL-1(图 5-a)，年均值分别为 (8.474±0.294)×106、(7.031±0.083)×106、(6.464±0.215)×106个·mL-1，养水机池塘最高，微孔曝气池塘次之，自然纳潮池塘最低，各池塘之间差异显著 (P＜0.05, 表2)。养水机池塘水中活的异养菌丰度在2、5、10、11月低于微孔曝气池塘(其中10、11月显著，P＜0.05)，其余8个月均高于微孔曝气池塘，且在1、3、4、6、8、9月显著(P＜0.05)；与自然纳潮池塘相比，养水机池塘除了10、11月略低以外 (P＞0.05)，其余10个月均较高，且在 1、2、4、6、7、8、12 月显著 (P＜0.05)，可见养水机有助于水中活的异养菌生长，尤其在温度较高的7—9月。

养水机、微孔曝气、自然纳潮池塘沉积物中活的异养菌丰度分别介于 (1.150～4.103)×107个·g-1、(0.626～2.473)×107个·g-1、(0.944～3.776)×107个·g-1(图 5-b)，年均值分别为 (1.945±0.127)×107、(1.202±0.304)×107、(1.866±0.160)×107个·g-1，养水机池塘年均值最高，自然纳潮池塘次之，微孔曝气池塘最低，养水机和自然纳潮池塘之间差异不显著，但均显著高于微孔曝气池塘 (P＜0.05，表2)。养水机池塘沉积物中活的异养菌丰度在 5、11月低于微孔曝气池塘 (其中5月显著，P＜0.05)，其余月份均较高，且在1、3、4、6、7、8、9、10、12月显著 (P＜0.05)；与自然纳潮池塘相比，养水机池塘在 3、4、5、6、7、10 月较高 (P＜0.05，6月除外)，但在 1、2、8、9、11、12 月较低 (P＜0.05，9、11月除外)，可见养水机能显著促进高温期沉积物中活的异养菌生长，有利于沉积物TOM的快速降解。

图5 池塘水和沉积物中活的异养菌和可培养弧菌丰度年变化a. 水中异养菌；b. 沉积物中异养菌；c. 水中弧菌；d. 沉积物中弧菌。Figure 5 Annual change of abundance of viable heterotrophic bacteria and cultivable Vibrio in water and sediment of each ponda. Heterotrophic bacteria in water; b. Heterotrophic bacteria in sediment; c. Vibrio in water; d. Vibrio in sediment.

养水机、微孔曝气、自然纳潮池塘水中可培养弧菌丰度月均值分别介于2.0～645.8 CFU·mL-1、2.0～951.7 CFU·mL-1、3.0～2 899.2 CFU·mL-1(图 5-c)，年均值分别为 (195.7±12.0)、(265.0±43.0)、(534.5±48.4) CFU·mL-1，年均值和年内变化幅度养水机池塘最小，自然纳潮池塘最大，各池塘年均值差异显著 (P＜0.05，表2)；与微孔曝气池塘相比，除了11、12月养水机池塘略高以外，其余月份均低，且在6、10月显著 (P＜0.05)；与自然纳潮池塘相比，养水机池塘除了在10、11、12月较高以外(其中11、12月显著，P＜0.05)，在其余月份均较低 (其中4—9月显著，P＜0.05)，可见在降低水中弧菌丰度方面，养水机有比较明显的优势。

养水机、 微孔曝气、 自然纳潮池塘沉积物中可培养弧菌丰度月均值变化分别为2.0～3 036.5 CFU·g-1、35.5～5 411.5 CFU·g-1、 2.0～3 290.5 CFU·g-1(图 5-d)，年均值分别为 (998.4±80.0)、(1 242.0±69.0)、(1 024.7±82.0) CFU·g-1，年均值和年内变化幅度养水机池塘最小，微孔曝气池塘最大，养水机池塘和自然纳潮池塘年均值差异不显著，但均显著低于微孔曝气池塘 (P＜0.05，表2)；与微孔曝气池塘相比，养水机池塘在1、7、8、10、12月较高 (P＜0.05)，其余月份均较低 (其中2、4、6、9、11月显著，P＜0.05)，可见养水机与微孔曝气装置相比，能降低沉积物中弧菌丰度；与自然纳潮池塘相比，养水机池塘在 10、11、12、1、7 月较高 (P＜0.05)，2、6 月与之相等，在3、4、5、8、9月较低 (其中3、8、9月显著，P＜0.05)，致使养水机池塘与自然纳潮池塘年均值无显著差异。

表2 各池塘活的异养菌和可培养弧菌丰度年均值Table 2 Annual average value of viable heterotrophic bacteria and cultivable Vibrio in ponds ±SD

表2 各池塘活的异养菌和可培养弧菌丰度年均值Table 2 Annual average value of viable heterotrophic bacteria and cultivable Vibrio in ponds ±SD

池塘Pond弧菌 Vibrio 异养菌 Heterotrophic bacteria水Water/(102 CFU·mL-1)沉积物Sediment/(103 CFU·g-1)Water/(106个·mL-1)水沉积物Sediment/(107 个·g-1)养水机 JWM 1.957±0.120a 0.998±0.080a 8.474±0.294a 1.945±0.127a微孔曝气 SA 2.650±0.430b 1.242±0.069b 7.031±0.083b 1.202±0.304b自然 Control 5.345±0.484c 1.024±0.082a 6.460±0.215c 1.866±0.167a

3 讨论

3.1 养水机对池塘异养菌丰度的影响

池塘环境中作为刺参饵料和参与物质循环[20-24]的异养菌，其丰度反映了刺参池塘饵料和有机质的多寡以及水质状况的优劣，因此其丰度和组成及其周年变化规律成为刺参池塘水质的重要监测指标之一[25-27]。本文测定的3种水质调控方式池塘异养菌丰度均高于文献报道[25-26]的异养菌丰度，这与测定方法有关，本文采用DVC法测定的细菌丰度是指水体或沉积物中所有的活细菌，而文献报道的细菌丰度采用平板涂布法，前者测定结果高于后者1～2个数量级。本文测定的养水机池塘水和沉积物中活的异养菌丰度在大多月份均显著高于自然纳潮池塘和微孔曝气池塘，这可能与养水机将上层DO丰富的水吸入位于池塘底部的生物包后又喷射出去，在池塘内形成一个微流动的水流有关，水流带动沉积物中营养物质输入到水体 (待发表)，供水体中活的异养菌生长繁殖，同时又将含氧量较高的水输入到池塘底部，供沉积物中活的异养菌生长繁殖，提高了微生物对池塘沉积TOM的降解能力[28]。尽管微孔曝气装置能从池塘底部铺设的空气管道输送氧气进入池塘，但形成的上升气泡难以形成水的流动，沉积物中营养难以进入水体，使池塘水中活的异养菌含量较低，而沉积物中TOM含量较高，但其细菌含量相对较低，其原因还有待进一步研究。本研究结果显示自然纳潮池塘沉积物中异养菌在1、2月出现高峰，与养水机和微孔曝气池塘以及文献资料结果[25-26]不同，初步推测可能与自然纳潮池塘沉积物中TOM高，且冬季比夏季DO高有关，冬季高的细菌类群组成有待于进一步研究。

3.2 养水机对池塘弧菌周年丰度的影响

弧菌是条件致病菌，丰度高于103CFU·mL-1时会引发虾病[29]。弧菌也是刺参养殖池塘环境中的自然菌群之一[30-32]，其丰度过高会引起刺参皮肤综合征[33-35]，因此池塘弧菌丰度及其周年变化也是水质检测的重要指标之一。本文测定的各池塘弧菌丰度和变化趋势与文献报道的[26-27,30-31]相似，均在夏季最高，冬季 (1、2月) 最低。池塘中弧菌丰度与温度、TOM含量[29]呈正相关，养水机的运转导致池塘TOM含量最低，而自然纳潮池塘和微孔曝气池塘TOM含量较高，这可能是导致养水机池塘弧菌丰度最低的主要原因之一，其他不利于弧菌生长的因素还需进一步研究。

3.3 养水机对刺参池塘水质的影响

实验表明，自然纳潮池塘在2和6月形成明显的温、盐跃层，与自然纳潮和微孔曝气池塘相比，养水机几乎消除了2和6月刺参池塘水体温跃层，减少了表底层DO差[11]。本试验进一步证明，养水机能显著提高6月DO，主要是因为在该月温、盐跃层的消失，提高了养水机池塘藻类含量[14]，这对提高温、盐跃层期刺参成活率和沉积物降解率具有重要意义。王祖峰[11]的实验表明，养水机池塘无机氮年均值显著低于微孔曝气和自然纳潮池塘，本试验结果与之相同，本试验再次表明养水机降低春、夏季池塘水中TAN、-N的效果优于微孔曝气装置，更优于自然纳潮换水方式，这可能与养水机促进了藻类生长有关[14]；养水机能显著提高春、夏季池塘水中活性磷浓度，与王祖峰[11]的结果一致，这可能与养水机能显著促进池塘沉积物TOM的降解，将沉积物有机磷释放到水中有关。

综上，养水机提高了6月温、盐跃层期池塘水中DO和春、夏、秋季水质，显著降低了沉积物中TOM含量，促进了活的非弧菌异养菌生长，抑制了可培养弧菌生长，有利于刺参生长。