基于DNA条形码的南海美济礁潟湖鱼卵种类鉴定与组成初探

卢芷程 ，李 敏 ，张 俊 ，张 帅 ，李红婷 ，蒋佩文 ，陈晓雷 ，曹漪婷 ，陈作志

（1. 中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部外海渔业开发重点实验室，广东 广州 510300；2. 上海海洋大学海洋科学学院，上海 201306； 3. 南方海洋科学与工程广东省实验室 (广州)，广东 广州 511458； 4. 大连海洋大学水产与生命学院，辽宁 大连 116023）

鱼类浮游生物 (Ichthyoplankton) 是鱼卵和仔稚鱼的统称。对其进行研究，可获得鱼类产卵场的直接证据，是渔业生物学和资源养护研究的重要前提[1]。以传统形态学方法鉴定鱼类浮游生物并非易事，其依赖于研究者的经验，且对于形态差异小的近缘物种难以区分[2-3]。目前中国已报道的海洋鱼类种类高达3 000多种[4]，但是已鉴定的鱼卵和仔稚鱼的种类不到300种[5]。通常已鉴定的仔稚鱼种类数仅占现存鱼种的十分之一，而已鉴定的鱼卵种类数也约为仔稚鱼种类数的十分之一[6]。

DNA条形码技术是利用生物体DNA中的一段保守片段对物种进行快速准确鉴定的新兴技术。对于鱼类的鉴定，DNA条形码通常基于线粒体细胞色素C氧化酶亚单位I (Cytochrome coxidase subunit I，简称COI) 基因[7]。随着DNA数据库的建立和完善 (如NCBI)，以及扩增技术的发展和成本的降低，基于分子标记的DNA条形码技术已成为鱼卵鉴定的重要手段，并已得到广泛应用[8]。如Ardura等[9]利用分子标记对北大西洋的鱼类浮游生物的研究发现，分子鉴定比形态鉴定具有更高的效率；王利华等[10]联合COI和Cytb基因对6种鲌属鱼类进行分子鉴定和系统发育分析，表明将COI和Cytb作为DNA条形码能够区分出近缘种。陈定标等[11]运用不同方法对浙江沿海鱼卵仔稚鱼样品进行鉴定，结果显示鱼卵分子鉴定比形态鉴定识别到种的比例更高。目前，国内也开展了不少基于分子标记对鱼卵的研究[12-14]，但是以往研究主要集中于中国近海、淡水鱼类。Chen等[3]利用COI标记对南海东沙群岛南部珊瑚礁海域采集的70个仔鱼样品进行鉴定和分析，结果显示优势科为天竺鲷科和鰕虎鱼科；吴娜等[15]对南沙永暑礁获得的71个鱼卵样品进行分子鉴定，认为双斑栉齿刺尾鱼 (Ctenochaetus binotatus) 是该海域的优势种。南海珊瑚礁鱼类浮游生物的研究尚处于起步阶段。

南沙群岛及其附近海域是中国唯一位于珊瑚礁核心区的海域，而位于南沙群岛东端的美济礁(115°32'E, 9°54'N)，是南沙群岛最大的环礁[16]。美济礁由外坡、礁坪和潟湖三部分组成，礁体呈环形，中部为潟湖，面积约36 km2，水深20～30 m，正南和西南方向各有一进出水道，属于典型的低潮高地珊瑚礁[17-18]。热带海洋季风气候，以及潟湖独特的水文环境，使其拥有较为稳定的高温条件和盐度[16]。美济礁水文环境优良，浮游植物种类丰富[19]，是南海珊瑚礁鱼类产卵育苗的重要场所，而目前对于美济礁鱼卵资源的研究尚有空缺。因此，本研究选取南海美济礁为研究对象，基于DNA条形码技术对其春、秋两季鱼卵的物种组成和季节动态进行了研究，旨在为南海岛礁种质资源的保护和利用提供基础信息。

1 材料与方法

1.1 样本采集

依托中国水产科学研究院南海水产研究所“南锋”号渔业调查船，于2019年5月 (春季) 和9月(秋季) 在南海美济礁潟湖进行鱼卵采集。

每个季节设立5个站点 (春季C1—C5，秋季Q1—Q5)，采样范围为 115°521'E—115°560'E、9°886'N—9°906'N (图 1)。样本采集根据《海洋调查规范》(GB 12763.6—2007) 进行，具体为采用浮游动物浅海Ⅰ型网 (网口内直径50 cm，网目0.505 mm)，置于小艇船尾水平拖网采集，拖网时间10 min，船速1.5 kn。样本用乙醇 (体积分数≥70%)保存，并于-20 ℃贮藏至运回实验室。

图1 美济礁调查站点图C1—C5为春季采样点；Q1—Q5为秋季采样点；该图基于审图号为GS (2019) 5218号的标准地图制作。Figure 1 Sampling stations in Meiji ReefC1-C5. Sampling stations of spring; Q1-Q5. Sampling stations of autumn; this map was made based on the standard map No. GS (2019) 5218.

1.2 鱼卵种类鉴定

挑取单个鱼卵，使用ddH2O洗脱乙醇，采用海洋动物组织DNA提取试剂盒 (天根，中国) 提取基因组DNA，-20 ℃保存备用。COI基因序列扩增引物为Fish-F1: 5'-TCAACCAACCACAAAGA CATTGGCAC-3'，和Fish-R1: 5'-TAGACTTCTGG GTGGCC AAAGAATCA-3'[20]。使用擎科生物Golden Star T6 Super PCR Mix (1.1×) 试剂盒，扩增体系 (总体积 25 μL)为：Mix 预混液 22 μL，正反向引物各1 μL，DNA模板1 μL。PCR反应采用降落 PCR 程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 4 s，10 个循环；98 ℃ 10 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 4 s，10 个循环；98 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃4 s，10 个循环；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃4 s，5个循环；最后72 ℃延伸4 min。用1%凝胶电泳检测PCR扩增产物，选取包含目的片段的产物，于广州擎科有限公司进行进行PAGE纯化及测序。

获得目的片段后，使用软件MEGA 5.01[21]排列比对，并进行剪切对齐。使用软件DNAsp[22]提取单倍型。对单倍型进行物种信息比对的数据库为美国国家生物技术信息中心 (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 数据库和生命条形码数据系统(BOLDSYSTEMS, http://www.boldsystems.org/index.php) 数据库。比对结果采用以下标准判别：相似度≥99%为同种；相似度92%～99%，则定为同属[23]。

根据陈真然[24]的研究，将鉴定到种的鱼卵按生态分布类型划分为礁栖性鱼类、大洋性中上层鱼类和深海鱼类3类。

1.3 数据分析

1.3.1 物种丰度和优势度的计算 物种丰度 (G)和优势度 (Y) 计算公式为：

式中：G表示单位体积海水中的鱼卵个数(粒·m-3)；N为全网鱼卵个体数 (粒)；V为滤水量(m3)[25]。

式中：ni表示第i个种类的物种密度 (粒·m-3)；fi表示第i个种类的出现频率[25]。本调查中，优势种以Y≥0.001为划分标准。物种丰度和优势度的计算均使用Excel 2010 软件完成。

1.3.2 群落结构的季节变化 为比较不同季节的鱼卵种类群落结构的相对丰度和变化程度。使用R语言的pheatmap包来分析不同季节各站点的鱼卵种类分布，对样本进行归一化处理，选用系统默认聚类方法。本研究中，相对丰度介于0～4，相对丰度≥3为优势种，以橙色填充作为标记。采用物种更替率 (E) 比较两季节的鱼卵组成差异，E的计算使用Excel 2010 软件完成。采用分类学多样性指数平均分类差异指数Δ+和分类差异变异指数Λ+分析群落多样性[26-27]，Δ+是指任意2个随机选取的不同物种间路径长度的理论平均值，该值不随物种数量而改变；Λ+表示Δ+偏离程度的平均值，反映群落中鱼卵种间关系分布的均匀程度[26]。相比于传统多样性计算方法，基于分类学地位的Δ+和Λ+不受采样方法、栖息地生态类型自然变化等影响，可解释群落的种间关系[26,28]。分类学多样性指数Δ+和Λ+使用软件Primer 5.2的Taxdtest软件包进行计算。不同指数的计算公式为：

式中：A为两季节间减少或者新增加的种类数量；B为两季节共有的物种数量[29]；wij为第i和j个种类在分类系统树中的路径长度；S为种类数。将门、纲、目、科、属、种6个分类等级间的加权路径长度的权重设置为100.000、83.333、66.667、50.000、33.333、16.667[30]。

2 结果

2.1 鱼卵数量统计

采集样本总数为345粒 (其中春季219，秋季126，表1)；春季鱼卵密度为0.95粒·m-3，秋季为0.54粒·m-3，春季是秋季的1.76倍。

表1 各站点序列数、鱼卵种数及其占比Table 1 Number of sequences, kinds of species and proportion in each site

2.2 鱼卵种类组成

成功扩增149条序列，实验成功率为43.19%(春季72条，秋季77条)。与数据库比对，共鉴定出37种鱼卵，隶属于3目23科31属，其中4种仅鉴定到属，分别为钝鰕虎鱼属未定种1 (Amblygobiussp.1)、眶棘鲈属未定种1 (Scolopsissp.1)、眶棘鲈属未定种2 (Scolopsissp.2) 和弱蜥鱼属未定种 1 (Scopelosaurussp.1) (表 2)。

表2 2019年美济礁春、秋季鱼卵种类组成Table 2 Species composition of fish eggs collected from Meiji Reef in spring and autumn, 2019

续表2 to be continued

鲈形目鱼卵种类和数量占比最大，鱼卵种类数为34种，占比91.89%，序列总数为145条，占比97.31%，其余为仙女鱼目2种，银汉鱼目1种。根据生态分布，可分为三大类型[24]：礁栖类群鱼卵 (28种)，大洋性中上层类群鱼卵 (6种) 以及深海类群鱼卵 (3种)。

本调查中发现颌圆鲹 (Decapterus macarellus)、圆翅燕鱼 (Platax pinnatus)、环状钝头鱼(Cymolutes torquatus)、玫鳍头齿天竺鲷 (Pristicon rhodopterus)、西里伯斯尖唇鱼 (Oxycheilinus celebicus)、巴氏下银汉鱼 (Hypoatherina barnesi) 等产卵种类在珊瑚礁海域的捕捞调查中未见记录。表明基于分子鉴定的鱼卵资源调查具有更好的发现隐秘种的能力。

2.3 鱼卵种类组成的季节变化

根据数量分布统计结果，不同季节的种类数量组成有所差异，春季鱼卵种类为13种，秋季为26种，春秋季均出现的鱼卵种类有青星九棘鲈(Cephalopholis miniata) 和黑斑绯鲤 (Upeneus tragula) 2种，隶属于鲈形目。春季特有鱼卵种类11种，分别属于灯笼鱼目、银汉鱼目和鲈形目；秋季特有的鱼卵种类24种，均属于鲈形目；春秋两季鱼卵种类更替率为94.59%。获得的37种鱼卵中鲈形目丰度最高，其在春季和秋季鱼卵组成中分别占95.83%和98.70%。

春季优势种是黑带鳞鳍梅鲷 (Pterocaesio tile，优势度0.001 9，丰度百分比11.27%)、犬牙锥齿鲷(Pentapodus caninus，优势度0.031 5，丰度百分比46.48%)、黑斑绯鲤 (优势度0.002 3，丰度百分比12.68%) 和青星九棘鲈 (优势度0.001 4，丰度百分比9.86%) 4种，而秋季优势种是黄鳍金枪鱼 (Thunnus albacares，优势度0.012 8，丰度百分比27.27%)和条纹眶棘鲈 (Scolopsis taenioptera，优势度0.004 2，丰度百分比15.58%) 2种 (表2)。

因为C5站点未获得有效的物种信息，故只以9个站点的物种种类构建相对丰度的热图。结果显示 (图2)，春季4个站点相对丰度最高的为犬牙锥齿鲷 (C1, C2)、青星九棘鲈 (C2)、黑斑副绯鲤(C3)、黑带鳞鳍梅鲷 (C4)；秋季5个站点相对丰度最高的鱼卵物种为圆翅燕鱼 (Q1)、六线巨齿天竺鲷 (Q2)、条纹眶棘鲈 (Q3, Q4)、黄鳍金枪鱼 (Q4,Q5)。其中，圆翅燕鱼是Q1站点唯一获得的鱼卵物种信息，因而不具有代表性。

图2 2019年美济礁春、秋季鱼卵种类组成和相对丰度的比较因C5站点没有获得有效序列，只选取9个站点的物种信息进行分析。以站点 (列) 为样本进行标准化，比较各物种相对丰度差异，以0为基准，4为相对丰度最大值。Figure 2 Comparison of species composition and relative abundance of fish eggs collected from Meiji Reef between spring and autumn in 2019Since there was no valid sequence in C5 site, only nine sites were selected for species information analysis. The data of each station (column) was used as one sample for standardization, and the relative abundance of each species was compared, with 0 as a benchmark and 4 as the maximum.

优势度和相对丰度的结果共同表明，美济礁春、秋季的鱼卵优势种差异较大，产卵种类呈现季节性变动。

美济礁春季鱼卵的Δ+为53.63，Λ+为111.45；秋季鱼卵的Δ+为50.77，Λ+为31.03 (图3)。表明美济礁春季产卵种类之间的亲缘关系比秋季产卵种类要更远，并且物种分类关系的均匀度远低于秋季。

图3 美济礁春、秋季鱼卵平均分类差异指数 (Δ+) 和分类差异变异指数 (Λ+) 95%置信漏斗曲线Figure 3 Funnel plot for average taxonomic distinctness (Δ+) and variation in taxonomic distinctness (Λ+) with 95% confidence limit of eggs species in Meiji Reef

3 讨论

3.1 美济礁鱼卵种类组成

此次调查共获得37种鱼卵，包含礁栖性鱼类、大洋性中上层鱼类和深海鱼类。根据中国水产科学院南海水产研究所1998—2018年的调查数据，美济礁礁栖鱼类达166种，其中鲈形目鱼类占77%[31]。在此次调查中，鲈形目鱼卵为主要组成部分，数量占总数的97.31%，符合南海鱼类群落构成特征。与研究资料对比发现，凹尾绚鹦嘴鱼 (Calotomus spinidens) 和犬牙锥齿鲷在2012—2018年美济礁鱼类资源调查中未发现[31]，而在本研究中再次发现了以上2个物种的存在，并新记录了多种南海珊瑚礁产卵种类。一般认为气候变化和人类活动会引起资源变动[32]，但在珊瑚礁资源调查中，由于采样方法和采样工具的限制，获得的鱼类种类可能具有选择性。绝大多数硬骨鱼类产出的鱼卵于海水中受精发育，鱼卵数量巨大，且大多具有浮性[24]。受精卵在水中随水流漂浮，该特性使其易于被采集。因此利用鱼卵对珊瑚礁鱼类种类组成进行调查，可作为传统采样调查方法的有效补充手段。

另外，本研究首次在美济礁发现了黄鳍金枪鱼的鱼卵。黄鳍金枪鱼具有重要经济价值，其在赤道和热带海洋性气候的海域全年均可繁殖，产卵行为多发生于28 ℃[33-34]，而美济礁的海表温度在27.6～29.2 ℃，平均为28.4 ℃[35]，符合其繁殖条件。早期有研究报道了黄鳍金枪鱼仔稚鱼在南海的分布，3—8月在南海中、西沙均有捕获[36]；Zhang等[37]采用回声测深仪对南海黄鳍金枪鱼幼鱼进行了调查，渔获的幼鱼体长337～458 mm；李炎璐等[38]曾在美济礁附近海域捕获52尾黄鳍金枪鱼幼鱼。上述研究虽然都捕获到了幼鱼，但由于金枪鱼游泳能力强，难以确定其产卵场的具体范围。本研究为南沙美济礁珊瑚礁海域作为黄鳍金枪鱼产卵场之一提供了直接证据。

3.2 美济礁鱼卵种类组成与分布特征的季节变化

美济礁鱼卵的资源密度季节变化较小，春季鱼卵密度 (0.95 粒·m-3) 是秋季 (0.54 粒·m-3) 的 1.76倍。王九江等[39]对大亚湾鱼卵的调查显示，春季鱼卵密度约为0.98粒·m-3，夏季为1.21粒·m-3，秋季为0.17粒·m-3，冬季为0.09粒·m-3，结果显示大亚湾海域春季鱼卵密度是秋季的5.76倍，夏季鱼卵密度是冬季的13.44倍，认为温度、溶解氧、盐度和pH对鱼卵有重要影响。美济礁年均气温变化幅度在1 ℃左右，全年温度差异不明显[35]。与近海相比，美济礁珊瑚礁海域处于热带，具有充足的光照和稳定的气候条件，且潟湖内盐度条件较为稳定。Isari等[40]对红海珊瑚礁附近海域幼鱼的调查显示，近岸的幼鱼丰度具有明显的季节变化。与红海珊瑚礁的片状分布不同，美济礁的礁盘呈环状，礁盘内环境相对更稳定。Zhao等[41]对南沙美济礁和渚碧礁珊瑚覆盖率进行研究，发现两岛礁的珊瑚平均覆盖率为21%，表明南沙群岛南部的珊瑚群落处于相对健康的状态。因此认为美济礁的气候环境全年适宜鱼类繁殖。

美济礁春、秋两季的产卵种类差异很大，且春、秋季各站点鱼卵种类组成不均。秋季，Q4和Q5采样点所获得的鱼卵大部分属于大洋性种类和深海类群，剩余部分为鲈形目种类；靠近这2个点的Q3和Q1种类和数量均较少，均为礁栖类群的鱼卵；而Q2有较丰富的种类，均属礁栖鱼类。春季，与Q4和Q5相近的采样点中，未发现大洋性种类和深海类群，且鱼卵的种类数与其他点无明显差别。推测大洋性鱼类和深海种类的繁殖行为可能会导致礁栖鱼类产卵地点的转移甚至迁出，但具体关系有待持续观察并进一步研究以提供更多信息。

优势度和密度的结果共同表明，不同季节的鱼卵优势种种类组成差异较大。与优势度相似，相对丰度分析可显示群落优势物种，且结果十分明了，但在样本数量极少的情况下，相对丰度结果可能会与实际数量产生差异。因此，使用相对丰度分析优势种时，在有条件的情况下，应尽量丰富样本总量，从而避免误差。

美济礁春、秋季的Δ+和Λ+结果反映了春季产卵种类之间的亲缘关系比秋季要更远，而物种分类关系的均匀度远低于秋季，两者均低于1998—2018年的年平均值[31]。与附近生境永暑礁相比(表3)，美济礁产卵种类中，不仅有典型的珊瑚礁礁栖鱼类，还存在大洋性中上层种类和深海种类，产卵种类之间的亲缘关系要更远，故而美济礁的Δ+要更高。

表3 相似生境的鱼卵平均分类差异指数 (Δ+) 及分类差异变异指数 (Λ+)Table 3 Average taxonomic distinctness (Δ+) and variation in taxonomic distinctness (Λ+) in similar economical systems

4 结论

基于DNA条形码的美济礁春、秋季的鱼卵种类组成和多样性分析发现，美济礁产卵种类多样性较丰富，鱼卵密度季节性变动较小。美济礁的鱼类产卵行为具有一定的季节偏好性，产卵物种更替现象明显，而南海鱼类繁殖行为是否同样存在季节偏好性，需要今后进行长期、持续性调查研究。南海美济礁的产卵鱼类除了有礁栖性鱼类外，还有多种深海鱼类和大洋性中上层鱼类，说明南海珊瑚礁生态系统在维护深海和大洋生态系统稳定性中起重要作用，建议将美济礁作为珊瑚礁鱼类重要产卵场进行全年保护。

另外，本实验中序列扩增的成功率并不高，可能由于部分鱼卵腐败，导致DNA降解，可考虑在船上即时进行鱼卵核酸的提取，从而减少核酸降解带来的影响。相比依赖于手钓、延绳钓、流刺网等传统采样方法，基于分子鉴定的鱼卵采集调查方法对环境和生物资源破坏更小，且有利于发现隐秘种和未知种，是一种有效的资源调查补充手段。

致谢：感谢广东海洋大学侯刚老师给予的技术指导，感谢蔡研聪、杨玉滔和“南锋”号船员在样品采集上的帮助，感谢王栋梁、方艺菲和李媛洁等在论文写作上给予的帮助！