活性维生素D3对人肾小球系膜细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

刘 刚，任国臣，杨晓萍

(石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832000)

目前慢性肾脏病在人群中的发病率逐年升高，我国成人人群中慢性肾脏病患病率为10.8%[1-2]。慢性肾脏病已成为严重危害人类健康的公共问题，患者的治疗耗费了巨额的医疗资源，给家庭和社会造成了沉重的负担。研究表明，活性维生素D3具有抑制肾小球系膜细胞增殖，促进细胞凋亡的作用，许多凋亡基因参与了肾小球系膜细胞凋亡，其中以Bcl-2为代表的一组凋亡调节基因对细胞凋亡起着至关重要的作用[3-5]。为进一步深入探讨活性维生素D3对系膜细胞的作用机制，本实验观察了活性维生素D3对体外培养的人肾小球系膜细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响，以期为其临床运用提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1细胞株与试剂 人肾小球系膜细胞株(湘雅医学院中心实验室提供)。磷酸酶抑制剂、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物公司)，胞质胞核蛋白提取试剂盒(南京凯基生物公司)，蛋白Marker(北京全式金生物公司)，兔多抗GAPDH(杭州贤至生物公司)，兔单抗Bcl-2(CST)，兔多抗Bax(武汉三鹰生物公司)，细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司)，1,25-二羟基维生素D3[1,25-(OH)2D3，Sigma公司]，MEM粉剂(GIBCO公司)。

1.2仪器与设备 超净工作台(苏州集团安泰空气技术有限公司)，CO2恒温培养箱(SANYO)，倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)，低速离心机(Eppendorf)，流式细胞仪(Beckmancoulter)，酶标仪(Thermo)。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养 将人肾小球系膜细胞从液氮中取出，复温后用含10%胎牛血清的完全培养基在37 ℃、 5% CO2饱和湿度条件下培养。细胞密度达80%时，加入1～2 mL 0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1∶3的比例传代，同样条件下继续扩大培养。

1.3.2实验分组及干预 收集对数生长期的人肾小球系膜细胞，按3.0×105个/孔接种于6孔板中，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养；待细胞贴壁后，弃去上清液，将细胞分为4组。空白对照组加入MEM正常培养基，高糖组加入含30 mmol/L葡萄糖的MEM培养基，VD3干预组加入含10-8mol/L 1,25-(OH)2D3的MEM培养基，联合干预组加入含10-8mol/L 1,25-(OH)2D3和30 mmol/L葡萄糖的MEM培养基，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.4观察指标及方法

1.4.1细胞形态观察 各组培养48 h后收集细胞，在光学倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.4.2细胞凋亡检测 细胞形态观察后，用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，800×g离心5 min，去上清，加PBS重悬，用PBS将细胞润洗2次，800×g离心5 min，流式细胞仪上机检测细胞凋亡率。

1.4.3Bcl-2、Bax蛋白表达检测 采用Western blot法检测：收集干预处理48 h后的人肾小球系膜细胞，每孔加入1 mL 4 ℃预冷的PBS洗涤，共3次，按1 mL RIPA裂解液加10 μL PMSF(100 mmol/L)于冰上裂解细胞30 min，4 ℃下13 300×g离心5 min取上清。用BCA试剂盒检测总蛋白浓度，用DG-3022A酶标仪测定OD 568，根据标准蛋白浓度和相应的OD值计算直线回归方程，根据蛋白样品OD值，利用回归方程计算出样品蛋白浓度。灌制12%的分离胶，5%浓缩胶的凝胶，吸取40 μg蛋白样品和MAKER加入上扬空，120 V恒压电泳，转膜至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h，将兔多抗GAPDH、Bcl-2及Bax按比例稀释，4 ℃孵育过夜，TBST充分洗涤，加HRP标记二抗1∶50 000稀释，室温孵育2 h，TBST充分洗涤，ECL显色，胶片曝光，扫描成像。用BandScan分析胶片灰度值。

2 结 果

2.1各组人肾小球系膜细胞形态学表现 显微镜下观察：空白对照组人肾小球系膜细胞呈梭形，形态多不规则，胞质清亮，折光性好，细胞核圆形、色较深，可见分裂的细胞核；与空白对照组相比，高糖组、VD3干预组、联合干预组的细胞数目依次减少，细胞体积缩小、胞核皱缩，部分细胞漂浮，胞质中有空泡形成，可见凋亡小体。见图1。

图1 显微镜下各组人肾小球系膜细胞形态(×100)

2.2各组人肾小球系膜细胞凋亡情况 空白对照组、高糖组、VD3干预组和联合干预组的细胞凋亡率分别为(2.150±0.135)%、(7.833±0.326)%、(12.900±0.301)%、(16.967±0.630)%，高糖组、VD3干预组和联合干预组均明显高于空白对照组(P均<0.05)，VD3干预组和联合干预组均明显高于高糖组(P均<0.05)，联合干预组均明显高于VD3干预组(P均<0.05)。见图2。

图2 各组人肾小球系膜细胞凋亡情况

2.3各组人肾小球系膜细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达情况 高糖组、VD3干预组和联合干预组Bcl-2蛋白表达量及Bcl-2/Bax均明显低于空白对照组(P均<0.05)，VD3干预组和联合干预组均明显低于高糖组(P均<0.05)，联合干预组明显低于VD3干预组(P均<0.05)；高糖组、VD3干预组和联合干预组Bax蛋白表达量均明显高于空白对照组(P均<0.05)，VD3干预组和联合干预组均明显高于高糖组(P均<0.05)，联合干预组明显高于VD3干预组(P<0.05)。见图3及表1。

图3 各组人肾小球系膜细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达情况

表1 各组人肾小球系膜细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达量及Bcl-2/Bax比较

3 讨 论

系膜细胞作为肾脏的主要固有细胞，其异常增殖及其细胞外基质的沉积是系膜增生性肾小球肾炎的主要病理特征[6-7]，也是导致肾小球硬化，使各种肾小球肾炎向终末期肾病发展的关键环节。因此，抑制系膜细胞增殖，促进其凋亡，是控制和治疗系膜增生性肾小球肾炎的重要靶点[8]。

相关研究显示，活性维生素D3可通过调控凋亡相关基因的表达而抑制人肾小球系膜细胞的增殖，加速细胞凋亡[9-10]。目前有关细胞凋亡的分子机制研究多数认为，细胞凋亡主要依靠受体途径、线粒体途径及内质网途径实现[11]。Bcl-2蛋白家族和胱蛋白酶(Caspase)家族在众多凋亡调控基因中最受关注，因为线粒体途径主要由Bcl-2蛋白家族调控。Bcl-2家族蛋白分两类，一类为抗凋亡基因，Bcl-2蛋白在抑制细胞凋亡中起重要作用，其可能机制为促进谷胱甘肽进入细胞核，导致核内氧化还原失衡，降低Caspases蛋白酶的活性，从而抑制细胞凋亡的发生[12]；另一类为促凋亡基因，如Bax蛋白，其可通过增强Caspases蛋白酶的活性，对抗Bcl-2蛋白的抗凋亡作用而诱导凋亡的发生；另外Bcl-2蛋白可与Bax蛋白相结合，减弱Bax蛋白的促凋亡作用而进一步抑制凋亡，Bcl-2与Bax的比例是调控凋亡的关键因素[13-14]。

在线粒体上，Bcl-2家族成员可通过调节线粒体外膜通透性来调节细胞凋亡；除此之外，Bcl-2家族成员还可在多种生理和病理环境的刺激下通过改变在内质网上的分布，影响内质网的稳态，诱导内质网应激(ERS)的发生，从而激活Caspase家族、Bcl-2家族等凋亡相关信号分子，诱导细胞凋亡。既往研究显示，通过提高培养基中葡萄糖的浓度可诱导系膜细胞凋亡，其机制可能与启动ERS有关[15-16]。

本实验发现高糖培养基培养的人肾小球系膜细胞凋亡率明显高于空白对照组，与高红红等[17]的研究结果一致；并发现高糖干预后，系膜细胞中Bcl-2蛋白表达量减少，Bax蛋白表达量增加，二者比例下调。其机制可能为高糖刺激可加速损伤血管内皮细胞，损伤DNA，诱导ERS的发生，跨膜蛋白被激活，进一步激活Bcl-2家族的凋亡相关信号分子，打破内质网的稳态，诱导细胞凋亡。实验结果还显示，VD3组系膜细胞凋亡率及Bax蛋白表达量明显高于高糖组，Bcl-2蛋白表达量及Bcl-2/Bax明显低于高糖组，与本课题组的前期研究结果相符[18-19]。考虑1,25(OH)2D3的促凋亡作用可能通过Akt磷酸化Bcl-2家族中的促凋亡因子实现，Bcl-2、Bax基因可通过线粒体途径介导Cyt-C等物质释放，进一步提高Capase-9、Capase-3蛋白的表达，促进细胞凋亡的发生。将活性维生素D3作用于高糖诱导下的人肾小球系膜细胞进行联合干预，细胞凋亡率高于VD3组，Bcl-2蛋白表达量进一步减少，而Bax蛋白表达量进一步增加，二者比例进一步下调，作用机制考虑与二者共同作用激活了内质网通路与线粒体通路引起协同作用有关。

综上所述，活性维生素D3干预高糖诱导下的人肾小球系膜细胞可显著抑制Bcl-2蛋白的表达，增加Bax蛋白的表达，从而诱导细胞凋亡，清除过度表达的系膜细胞及炎性细胞，促进肾组织修复，延缓疾病的进展，为活性维生素D3的临床应用提供了理论依据，但其具体机制仍需在后期研究中进一步阐述。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。