化浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠炎性细胞因子、环氧合酶2及前列腺素E2调控作用的研究

李 燕，娄莹莹，李佃贵，杨 倩，霍永利，贾 宁，宋艳琦，王亚敏

(1. 河北中医学院，河北 石家庄 050200；2. 河北省中医院，河北 石家庄 050000；3. 唐山市血液中心，河北 唐山 063000；4. 河北省沧州中西医结合医院，河北 沧州 061001)

溃疡性结肠炎属于炎症性肠病，其临床主要表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便及里急后重等，且病程迁延，久治难愈。该病机制不完全明确，是多因素、多途径综合作用的结果，其发病率逐年递增，且与结肠恶性肿瘤密切相关。因此如何提高临床疗效、控制发作、延缓复发、提高生活质量是目前研究的重点。国医大师李佃贵教授认为溃疡性结肠炎主要病机为“浊毒内蕴肠腑，损膜伤络”，化浊解毒方经临床验证为治疗该病的有效方剂。本研究通过动物实验进一步探讨了化浊解毒方治疗溃疡性结肠炎的作用，并揭示其潜在机制。

1 实验材料与方法

1.1动物 清结级雄性健康Wistar大鼠50只，体重(220±20)g，购自河北医科大学实验动物中心，动物合格证编号：1808139，常规适应性喂养1周后用于实验。

1.2药物 化浊解毒方由白头翁15 g、藿香12 g、黄连12 g、茵陈15 g、白花蛇舌草15 g、半枝莲12 g、当归12 g、芍药20 g、茯苓15 g、白术6 g、广木香9 g、秦皮15 g、地榆12 g、儿茶6 g、苦参9 g、仙鹤草15 g组成，单味药物购于河北省中医院，药物煎制并浓缩至所需浓度，4 ℃保存。化浊解毒方低剂量、高剂量分别相当于成人用量(3.33 g/kg)的6.25倍、12.5倍，即20.8 g/kg、41.6 g/kg。美沙拉嗪肠溶片(葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司，国药准字H19980148，规格：250 mg/片)研成细粉，溶于蒸馏水，配制成0.3 g/kg溶液。

1.3主要试剂及仪器 2,4,6三硝基苯磺酸(TNBS，美国Simga)；环氧合酶2(COX-2)抗体(北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-0732R)；前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)；离心机TDL-5-A(上海安亭)；电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；600型电热恒温水箱(天津泰斯特)；酶联免疫检测仪(MK3 FC)。

1.4实验方法 采用随机数字表法将50只Wistar大鼠分成正常组、模型组、美沙拉嗪组、化浊解毒方高低剂量组、化浊解毒方低剂量组，每组10只。大鼠禁食24 h后，采用乙醚麻醉，然后倒置大鼠，将直径2 mm硅胶管采用石蜡油润滑后，插入倒置大鼠肠道7～8 cm，正常组大鼠灌以生理盐水约0.8 mL，其余组大鼠按照100 mg/kg即4 mL/kg给予造模剂(等体积比例混合5%TNBS与50%的乙醇，配置成含有TNBS 25 mg/mL的混合液[1])，垂直倒置大鼠约30 s，使其在肠道内充分发挥作用。造模结束后，恢复大鼠正常饮食、饮水，保证环境清洁、通风良好、湿温度适宜。第2天，模型组、美沙拉嗪组、化浊解毒方高剂量组各有1只大鼠死亡。随机选取模型组和化浊解毒方高剂量组造模大鼠各1只，断头处死，以大鼠结肠组织出现不同程度的充血水肿，且有糜烂及溃疡形成为造模成功。造模成功后，化浊解毒方高、低剂量组分别给予化浊解毒方41.6 g/kg、20.8 g/kg灌胃，美沙拉嗪组给予美沙拉嗪混悬液0.3 g/kg灌胃，正常组、模型组给予等体积生理盐水灌胃，均每日1次，连续14 d。

1.5观察指标及方法

1.5.1疾病活动指数(DAI)评分 在实验的整个过程中，观察大鼠精神、毛发、体重、粪便、饮食情况，并详细记录，参照Murano等[2]制定的标准计算各组大鼠DAI评分，DAI=(体重下降分数+大便性状分数+便血分数)/3。

1.5.2血清炎性细胞因子水平 灌胃结束后处死大鼠，眼眶后静脉丛取血，静置待凝，2 500 r/min离心15 min，取血清-70 ℃冰箱冻存。采用ELISA法测定各组大鼠血清IL-10、IL-6、PGE2水平，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.5.3结肠组织中COX-2蛋白表达情况 自距肛门1 cm、3 cm处及溃疡处取3块组织，固定于10%福尔马林溶液，常规石蜡包埋、切片，然后按照免疫组化步骤进行操作[3]：石蜡切片脱蜡至水，用3% H2O2室温孵育5～10 min，蒸馏水冲洗后，PBS浸泡5 min×2次，5%～10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10 min，滴加一抗工作液，37 ℃孵育1～2 h或4 ℃过夜，PBS 冲洗，2 min×3次。二抗37 ℃孵育10～30 min，滴加适量辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min，PBS 冲洗，5 min×3次。显色剂显色3～15 min，冲洗、复染、脱水、透明、封片后显微镜下观察，阳性染色结果为细胞浆、胞核出现棕黄色颗粒，采用数码显微镜和图像采集系统观察并照相，应用Image pro-Plus 6.0图像分析软件测定其平均光密度值。

2 结 果

2.1各组大鼠DAI评分比较 正常组DAI评分为0分，模型组、美沙拉嗪组、化浊解毒方高剂量组、化浊解毒方低剂量组DAI评分分别为(2.48±0.11)分、(0.71±0.04)分、(0.62±0.03)分、(1.51±0.12)分。美沙拉嗪组、化浊解毒方高剂量组、化浊解毒方低剂量组DAI评分均明显低于模型组(P均<0.05)，美沙拉嗪组、化浊解毒方高剂量组均明显低于化浊解毒方低剂量组(P均<0.05)，化浊解毒方高剂量组与美沙拉嗪组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.2各组大鼠血清IL-6、IL-10、PGE2水平比较与正常组比较，模型组大鼠血清中IL-6、PGE2水平均明显升高(P均<0. 05), IL-10水平明显下降(P<0.05)。与模型组比较，美沙拉嗪组、化浊解毒方高剂量组、化浊解毒方低剂量组血清IL-6、PGE2水平均明显降低(P均<0.05)，IL-10水平均明显升高(P均<0. 05)；美沙拉嗪组、化浊解毒方高剂量组血清IL-6、PGE2水平均明显低于化浊解毒方低剂量组(P均<0.05)，IL-10水平均明显高于化浊解毒方低剂量组(P均<0.05)；化浊解毒方高剂量组各指标水平与美沙拉嗪组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠血清PGE2、IL-6、IL-10水平比较

2.3各组大鼠结肠组织中COX-2蛋白表达情况正常组、模型组、美沙拉嗪组、化浊解毒方高剂量组、化浊解毒方低剂量组结肠组织中COX-2蛋白表达平均光密度值分别为12.71±1.89，28.39±2.13，17.63±1.92，16.16±2.03，20.68±1.86。模型组明显高于正常组(P<0.05)；美沙拉嗪组、化浊解毒方高剂量组、化浊解毒方低剂量组均明显低于模型组(P均<0.05)，美沙拉嗪组、化浊解毒方高剂量组均明显低于化浊解毒方低剂量组(P均<0.05)，化浊解毒方高剂量组与美沙拉嗪组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

溃疡性结肠炎是免疫、遗传、感染、环境等多种因素综合作用的结果[4]，具有病程长、反复发作、缠绵难愈的特点，已成为全球性健康问题。免疫反应异常是溃疡性结肠炎的重要发病机制，细胞因子的平衡失调导致炎症介质的过度释放，进而造成结肠黏膜的病理性损伤[5-6]。IL-6由Th1细胞分泌，主要介导细胞免疫应答和细胞毒作用，具有促炎作用。研究发现，IL-6的过度表达会影响肠上皮细胞的通透性，引起炎性细胞浸润，从而发生肠道慢性炎症[6]；且IL- 6的表达水平与溃疡性结肠炎病情严重程度及病变范围密切相关[7]。IL-10属于Th2型细胞因子，是细胞免疫反应的负性调节因子，具有抗炎作用，其可以阻断免疫炎性反应发生、发展的多重环节，稳定肠道黏膜的内环境，还可以进一步调控IL- 6、IL- 8等的分泌，维持细胞因子的动态平衡[5]。

环氧合酶(COX)是花生四烯酸代谢的关键酶，可以催化各种内源性前列腺素的合成，其存在3种同工酶，即COX-1、COX-2和COX-3。COX-2是一种诱导型酶，兼具环氧化酶、过氧化物酶双重活性。正常生理状态下，COX-2通常不表达或低表达，但在炎性刺激或细胞因子的诱导下，COX-2可在炎性组织高表达，参与机体炎症的病理生理过程。研究表明，COX-2在溃疡性结肠炎的发生发展过程中发挥重要作用[8-9]。PGE2是一种重要的免疫调节因子，其可以增加血管通透性，进而引起组织水肿[10]，同时可引起炎细胞浸润，导致结肠黏膜发生炎症反应，使组织破坏及溃疡形成[11-12]。Tammali等[13]研究表明，抑制COX-2及PGE2的表达，可对抗或预防二者诱发癌变的作用。

中医学将溃疡性结肠炎归属于“泄泻”“痢疾”“肠风”“便血”等范畴。国医大师李佃贵教授继承创新，提出了溃疡性结肠炎浊毒致病论。浊毒内蕴，气机不畅，不通则痛，因而出现腹痛；湿浊下注肠腑，大肠传导功能失司，可出现腹泻；浊毒与气血胶结，损膜伤络，从而出现黏液脓血。本病缠绵难愈，反复发作，正与浊毒的致病特点相契合。基于方证结合，在当归芍药散、白头翁汤、香连丸等基础上自拟具有化浊解毒、理气和血功效的化浊解毒方，经前期临床观察证实该方对溃疡性结肠炎具有较好治疗作用[14]。本动物实验结果显示，化浊解毒方可显著改善溃疡性结肠炎大鼠的一般状态，降低DAI评分及血清IL-6、PGE2水平，升高IL-10水平，同时能够抑制结肠组织中COX-2的表达，且化浊解毒方高剂量效果更佳。提示化浊解毒方可能是通过下调IL-6、COX-2的表达，进而抑制PGE2分泌，同时促进IL-10表达，进而恢复细胞因子的平衡，抑制溃疡性结肠炎大鼠结肠组织的炎症损伤，促进结肠黏膜修复，改善溃疡性结肠炎的症状，延缓疾病进程。但化浊解毒方治疗溃疡性结肠炎的作用机制复杂，有待深层次挖掘，开拓治疗溃疡性结肠炎的新思路。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。