茅苍术组培快繁技术研究

李亮杰 楚宗丽 李猛 孙晓伟 王鹏博

摘 要：茅苍术是重要的道地药材，但由于繁殖困难和采伐过度，导致野生资源濒危，产量大幅度下降。为解决这一问题，利用植物组织培养的方法，以茅苍术种子为外植体，对初代培养的建立及不定芽诱导、增殖和生根的适宜激素浓度进行了筛选，以期为茅苍术的组培快繁生产提供技术支持。结果表明：初代培养以种子去皮、0.1%升汞消毒10min效果最佳;不定芽诱导以MS+6-BA 3.0mg/L诱导率最高，配合NAA浓度0.4mg/L和0.8mg/L的不定芽诱导率分别为96.77%、95.78%。其次是MS+6-BA 2.0mg/L，添加NAA浓度0.2mg/L和0.4mg/L的诱导率分别为94.53%、95.22%。增殖培养以MS培养基添加6-BA 3.0mg/L的增殖系数最高，为11.88;其次是2.0mg/L，增殖系数在9.5以上;但以MS+6-BA 2.0mg/L+NAA0.4mg/L增殖系数和长势综合效果最好。生根培养以培养基配方为1/2MS+NAA0.5mg/L生根效果最佳。

关键词：茅苍术;组织培养;不定芽;增殖;快繁

中图分类号 Q949.783.5 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）21-0033-05

Absrtact： Atractylodes lancea is an important Chinese genuine medicine.However， due to the difficulty of reproduction and over exploitation， wild resources are endangered and the yield is greatly reduced in recent years.To solve this problem， the keys for the rapid propagation of tissue culture for Atractylodes lancea were studied here including the construction for primary culture， adventitious bud induction， proliferation and rooting culture using the mature seeds as material， provides a technical support for rapid propagation of Atractylodes lancea. The results showed that seeds without coat and mature seeds were disinfected with 0.1% HgCl for 10minutes had the best effection.For adventitious buds induction， MS+6-BA 3.0mg/L has the most induction rate， combined with the NAA concentration of 0.4mg/L and 0.8mg/L showed the induction rate of 96.77% and 95.78%， respectively.The second is Ms+6-BA 2.0mg/L， combined with the NAA concentration 0.2 and 0.4 showed the induction rate of 94.53% and 95.22%， respectively.For proliferation， MS+6-BA 3.0mg/L has the most propagation coefficient of 11.88，the second is 2.0mg/L， with the propagation coefficient more than 9.5.But with MS+6-BA 2.0mg/L+NAA0.4mg/L was the best for the comprehensive effect of proliferation coefficient and growth.1/2 MS+NAA0.5mg/L was the best medium for rooting.

Key words： Atractylodes lancea; Tissue culture; Adventitious bud; Proliferation; Rapid propagation

苍术（Atractylodes）是菊科苍术属（Atractylodes）多年生植物，我國有朝鲜苍术[Atractylodes.coreana （Nakai） Kitam.]、茅苍术[Atractylodes lancea （Thunb） DC.]、北苍术[Atractylodes chinensis （DC） Koidz.]、关苍术（Atracylodes japonica Koidz.Ex Kitam.）及白术（Atractylodes macrocephala Koidz.）5类[1，2]。茅苍术即为南苍术，《中国植物志》将茅苍术和北苍术归为苍术一个种[2]。茅苍术主产于江苏、安徽、河南等地，为著名的道地药材[3]。

茅苍术根茎入药，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目等作用[4]，主要药效组分为挥发油类物质[5-7]，南方气候是茅苍术产生优质组分的必要条件[8]。目前对苍术需求逐年增加，而生长土地减少和人们对野生苍术的采挖，导致茅苍术产量锐减[9-12]。同时茅苍术生长缓慢，花为雌雄同株或异株，不易受精，种子发芽率低[13]，依靠有性繁殖远不能满足对茅苍术的需求，植物组织培养技术为茅苍术的快速繁殖提供了有效途径，同时能够除去由于多年无性繁殖携带的病菌[14，15]。研究发现，组织培养途径不影响药材化学成分的积累[16，17]。

国内学者对茅苍术的组织培养技术进行了探索，研究了影响茅苍术组培快繁效率因素，如不同灭菌方式和处理时间对初代培养的影响[18-21]，增殖培养基和生根培养基对茅苍术增殖和生根的影响[18-25];研究了不同初代培养材料的培养效果，常用的材料有苍术种子[18-20]、根茎侧芽[21]、带腋芽茎段[22]等;研究了主要的增殖方式，主要通过愈伤诱导和不定芽增殖，愈伤诱导的外植体有叶片、叶柄[23-24]、根、胚轴[19，25]、子叶[19]等。

茅苍术在河南信阳有野生分布，并有较大面积的仿野生种植。近年来，随着市场对茅苍术的需求量逐年增加，茅苍术的种苗繁殖慢是急需解决的问题。近十几年来，国内学者虽然针对茅苍术组织培养已展开了一定的研究，但真正将组培快繁技术应用到茅苍术的组培工厂化生产，仍有很多问题需要进一步研究。为此，本研究利用成熟种子为外植体，探究去种皮后的启动培养、不定芽诱导和快繁及生根培养等生产程序中适宜的繁殖方式和适宜的培养基，研究不同世代组培苗对植物激素的反应，为茅苍术种苗的工厂化生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料 2019年和2020年的9—11月，于信阳大别山道地药材示范园采集成熟种子。

1.2 培养基 培养基以MS或1/2MS（大量元素减半，其他不变）为基本培养基，添加不同浓度的激素组合（mg/L），添加蔗糖3%，琼脂0.7%，pH值调为5.8，设置不同组合。培养基灭菌压力0.1MPa，温度121℃，灭菌时间25min。

1.2.1 初代培养基 2种配方，M1：MS基本培养基;M2：MS+6-BA1.0+NAA0.5+GA1.0（单位mg/L，下同）。

1.2.2 丛生芽诱导与增殖培养基; 6种浓度组合，配方如下：

Z1a：MS+6-BA1.0+NAA0.1， Z1b：MS+6-BA1.0+NAA0.2;

Z2a：MS+6-BA2.0+NAA0.2， Z2b：MS+6-BA2.0+NAA0.4;

Z3a：MS+6-BA3.0+NAA0.4， Z3b：MS+6-BA3.0+NAA0.8。

1.2.3 生根培养基 3个激素浓度，配方如下：

1/2MS+NAA0.2;1/2MS+NAA0.5;1/2MS+NAA1.5

1.3 培养方法

1.3.1 外植体处理 选健壮的种子加洗洁精清洗干净，流水冲洗30min，无菌水浸泡3～6h，超净工作台上75%酒精浸泡30s，0.1%升汞消毒6～15min，无菌水冲洗3～5次。灭菌后种子分为剥去种皮（去皮并切去部分子叶，胚根接种）和保留种皮2种方式接种。

1.3.2 初代培养 消毒后的种子接种在初代培养基，每瓶接种2～3粒，针对不同种皮处理方式、不同灭菌时间，每处理接种20～30瓶，设置3个重复。置（23±1）℃条件下，5～10d统计污染情况，20d统计出苗情况。

1.3.3 诱导和增殖培养 将初代培养得到的无菌苗，切去根和叶片，胚轴保留叶腋生长点，转接到诱导培养基中，每瓶接种3块组织，每处理接种24瓶。35d统计出苗的组织块数。将上述丛生芽分离，接种到6种不同激素浓度的增殖培养基中，每瓶接种3个芽，每处理接种15瓶，35d后统计增殖芽数。

1.3.4 生根培养 将增殖所得的不定芽，3～4个叶后接种到生根培养基，每瓶接种2～4苗，30d统计生根率。以上处理分别3个重复。

1.3.5 统计方法 相关计算公式如下：

污染率（%）=污染种子数/接种种子数×100;

发芽率（%）=发芽种子数/接种种子数×100;

诱导率（%）=诱导出不定芽的芽数/接种芽数×100;

增殖系数（%）=增殖后不定芽個数/接种芽数×100

利用Excel 2010和SPSS 26.0对数据进行分析，多重比较采用Duncan′s法。

2 结果与分析

2.1 初代培养的建立

2.1.1 培养基和种皮处理方式对种子萌发和生长的影响 接种后的种子培养20d统计出苗率，未剥种皮处理在M1、M22种培养基上出苗率为分别为34.68%、39.19%，剥皮处理后出苗率分别为64.75%、79.79%，相同培养基不同处理方式之间差异达极显著，对于相同处理不同培养基之间，剥皮处理出苗率差异显著，未剥皮处理差异不显著（见表1）。

未剥种皮和剥皮幼苗长势不同，剥皮的种子发芽后幼苗叶片淡绿，茎伸长，有1～2条初生根长成正常植株。未剥皮幼苗茎伸长发芽速率慢（图1）。在初代培养中，两类培养基幼苗长势不同，不添加6-BA的培养基M1中，幼苗伸长（图2A），添加有细胞分裂素6-BA的培养基M2中，根和伸长生长不明显，初代苗有增殖现象（图2B、C）。

2.1.2 灭菌时间对初代培养影响 5个灭菌时间，随着消毒时间的延长污染率逐渐降低（表2），6min、8min、10min3个时间污染率差异显著，10min以后，随灭菌时间的延长污染率降低差异不显著。随着消毒时间的延长出苗率升高，6min、8min、10min3个时间出苗率差异显著，但消毒10min以后随着消毒时间延长成苗率范围降低，综合污染率和成苗率，表明10min消毒效果最好。

2.2 不同激素浓度对不定芽诱导的影响 胚轴诱导培养3d，叶腋处嫩叶长出;7d伤口变大，有颗粒状凸起出现;15d外植体伤口可见愈伤组织，叶腋处出现丛生嫩芽;28d底部伤口长成坚硬、形状不规则的愈伤组织，叶片展开，生成丛生芽（图3 D、E、F）。不同激素浓度的培养基中，不定芽诱导率不同，在6-BA3.0、NAA0.4（mg/L）的Z3a号培养基中不定芽诱导率最高，为96.77%，其次是6-BA 3.0，NAA 0.8（mg/L）的Z3b号培养基，诱导率为95.78%，两者差异不显著，与含6-BA 1.0（mg/L）的Z1a、Z1b培养基诱导率差异显著，与含6-BA 2.0的Z2a、Z2b号培养基差异不显著（表3），表明含6-BA 3.0，NAA 0.4（mg/L）时培养基诱导能力最强。

2.3 不同激素浓度对不定芽增殖的影响 将诱导出不定芽切成单芽接种在增殖培养基中，统计增殖芽数并计算增殖系数，结果表明，培养基中6-BA为3.0（mg/L）时增殖系数最高，为11.88，为2.0（mg/L）时增殖系数在9.5以上，为1.0时增殖系数为5.0，差异显著（表4）。不同激素浓度对苗的长势有影响，6-BA为3.0mg/L时叶片不易伸长（图3A、B），6-BA为2.0时，低浓度NAA（0.2mg/L）不定芽伸长不明显（C：Z2a、F），NAA为0.4mg/L时，苗伸长，出现茎秆和节间（D：Z2b、G）。6-BA为1.0（mg/L）、NAA为0.1（mg/L）时叶片伸展（E、H）。表明适宜的细胞分裂素浓度需对应的生长素浓度才能利于苗的健壮生长。综合增殖系数和苗长势，培养基中6-BA为2.0、NAA为0.4（mg/L）时适合初代苗的增殖。同时发现，随着增殖世代的增加，组培苗对细胞分裂素反应敏感，增殖能力强，苗嫩，呈黄绿色（图4A），后面世代培养中，培养基不添加细胞分裂素可实现壮苗（图4B）。

2.4 生长素浓度对不定芽生根的影响 由表5和图5可知，3种生根培养基中，以NAA浓度0.5mg/L的生根率最高，为97.78%，生长速度最快，根长势最好，3种培养基对生根率的影响差异不显著，且生根率都在90%以上。表明3种培养基都可以进行生根培养，其中以配方1/2MS+NAA0.5mg/L效果最好。

3 讨论与结论

3.1 初代培养的建立 外植体表面灭菌是建立无菌培养的第一步，不同外植体灭菌难易程度不同，根据外植体的来源和老嫩程度的不同，利用升汞进行表面灭菌的时间一般在5～10min，时间越长灭菌越彻底，但对外植体损伤越大。在茅苍术的不同的外植体研究中，李西腾等利用根茎侧芽、李鸿盛等利用在光照培养箱种植块根获得的带腋芽茎段，利用次氯酸钠和升汞溶液结的方式进行消毒处理[21，22]建立无菌培养。而苍术种皮有绒毛，药液不易进入，成熟种子由于生长时间长，灭菌困难，巢建国等[19]采用的0.1%升汞消毒种子15min。本试验在成熟种子完成预处理后，去掉种皮后再消毒，0.1%升汞消毒10min达到理想的消毒效果。以种子为外植体的快繁中，种子萌发是快繁的基础，路成[26]等研究美女樱种子的组培表明，蒸馏水浸泡种子，并且切除两端0.01cm处以破坏种皮才可诱导成苗，不破坏种皮不可生苗。本试验对种子进行培养发现，将种皮剥去，损伤部分子叶有利于茅苍术种子萌发。

3.2 植株再生 组织培养中主要通过器官发生和体细胞胚胎发生2种途径获得再生植株，器官发生途径分为直接器官发生途径（外植体不需要脱分化形成愈伤组织而直接成苗）和间接器官发生途径（外植体经脱分化形成愈伤再分化形成苗）[27]，茅苍术主要是通过器官发生途径实现再生。巢建国等利用无菌苗分割成的胚根、胚轴、子叶和真叶多种材料直接诱导丛生芽，以胚轴诱导率最高[19]，宋刚等[25]在茅苍术规模化组培快繁研究中利用胚轴直接增殖再生。刘海萍等[23]、宋刚等[24]利用无菌苗的叶片、叶柄在添加2，4-D的培养基，通过诱导愈伤组织实现间接再生。本研究利用胚轴直接实现不定芽再生，虽然试验过程中也有愈伤组织产生，但未进行愈伤组织再分化，简化了再生程序，便于在生产中应用。

3.3 增殖培养 在增殖培养中，细胞分裂素浓度是影响增殖系数的关键，生长素影响种苗的生长和质量，刘海萍等[23]研究发现，6-BA在2.0～3.0mg/L、IBA为0.4mg/L时，芽的增殖率较高，苗长势好;当6-BA浓度大于3.0mg/L时，茅苍术的生长受到抑制;李西腾等[21]研究发现，MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L叶片丛芽诱导最高，但在继代的前期（2～3代）所用激素的浓度相对高些，6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L较好，随着继代代数的增加，要求激素的浓度降低，到8～10代时，6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L较好，认为可能是激素积累的原因。宋刚等[24]发现，6-BA10.mg/L+NAA0.15mg/L丛生芽增殖系数最高为15，但该报道未提供计算该增殖系数的基本苗数。本研究结果表明，6-BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L中增殖系数为7.4，虽不及6-BA 3.0mg/L高，但芽苗生长健壮，在后续继代增殖培养中，增殖芽数较高，但苗弱小，认为该浓度不宜长期在增殖培养中使用，与李西腾等[21]研究结果丛生芽增殖前期需要高浓度激素，但长期使用会对丛芽诱导产生影响的结果一致。笔者认为，在工厂化生产中，可以降低细胞分裂素浓度，采用6-BA浓度为1.0～1.5mg/L范围内进行快繁，以降低高浓度细胞分裂素对苗的影响，提高种苗质量。

关于生长素的浓度对苗生长的影响，刘海萍等[23]等研究发现，当IBA质量浓度小于0.4mg/L时，芽苗颜色浅，比较纤弱;当IBA质量浓度大于0.4mg/L时，芽的分化率低。本研究发现，当6-BA为2.0时，NAA为0.2mg/L不定芽伸长不明显（C：Z2a），为0.4mg/L时苗伸长，出现茎秆（D：Z2b）。6-BA为1.0mg/L时，NAA浓度为0.1mg/L叶片伸展，株型正常，表明适宜的细胞分裂素浓度需对应的生长素浓度才能利于苗的健壮生长。而6-BA为3.0mg/L，NAA为1.0mg/L比为0.6mg/L增殖率低，可能与生长素具有两重性、低浓度促进植物生长，过高浓度时抑制植物生长有关[28，29]。

本研究以剥皮种子为外植体进行培养有利于出苗和降低污染，初代培养增殖培养基以6-BA2.0+NAA0.4增殖效果理想。在后续增殖培养中，降低细胞分裂素浓度，有利于壮苗，生根培养基以配方为1/2MS+NAA0.5mg/L最适宜。

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（责编：张宏民）