白介素-1 受体1 胞外域的原核表达及鉴定

周永飞，韩顺子，赵丹莹，张健锋，常军亮，刘玉林，曹玉锋，刘景会

1.长春生物制品研究所有限责任公司，吉林长春130012；2.怡道生物科技（苏州）有限公司，江苏苏州215004

白介素-1（interleukin-1，IL-1）是人体内重要的细胞因子，不仅参与B 细胞的增殖与分化，还参与炎症反应等［1］，在真核细胞表面存在白介素-1 受体1（interleukin-1 receptor 1，IL-1R1）和白介素-1 受体 2（IL-1R2）两种受体，IL-1R1 是IL-1 的主要功能受体，IL-1 与 IL-1R1 及辅助受体（interleukin-1 receptor accessory protein，IL-1RAcP）结合后形成复合体，触发信号通路从而传导信号［2］。IL-1 与IL-1R1 结合后的信号传导与多种疾病的发生密切相关，如类风湿关节炎、痛风等多种炎性疾病及冷吡啉相关周期性综合征（cryopyrin-associated periodic syndromes，CAPS）、新生儿多系统炎症性疾病（neonatal onset multisystem inflammatory disease，NOMID）、成人 Still 病、川崎病等多种罕见疾病［3-5］。

人源化单克隆抗体作为治疗性药物已广泛应用于临床，目前已上市的药物有针对IL-1β 的人源化抗体卡纳单抗及IL-1R 拮抗剂等，作用机理均为阻断该信号通路的传导［6］。IL-1R1 单克隆抗体作为阻断该信号通路的一种方法，已有临床研究报道证明其效果显著，更长的给药周期避免了每天注射IL-1R 拮抗剂的不便，为类风湿性关节炎、痛风等多种疾病的治疗带来了新的思路［7-8］。本实验采用原核表达系统表达IL-1R1 胞外域，包涵体纯化后免疫小鼠，并对小鼠血清抗体进行鉴定，为后续单克隆抗体筛选及细胞受体功能的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、质粒及菌株 A375·S2 细胞由本公司细胞因子室提供；载体pET-28a、感受态E.coli DH5α、感受态OverExpress（DE3）均由本公司生物技术研究室保存。

1.2 主要试剂及仪器 RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、pfu-DNA 聚合酶、限制性内切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ、T4 DNA 连接酶、鼠抗His 标签单克隆抗体、凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒均购自北京全式金生物技术公司；IPTG 购自美国Merck 公司；鼠抗IL-1R1 多克隆抗体购自北京义翘神州公司；HRP 标记的羊抗鼠IgG、FITC 标记的羊抗鼠IgG 和Western blot 底物均购自北京中杉金桥生物技术公司；增强型DAB 显色液购自北京索莱宝科技公司；弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂均购自美国Sigma 公司；AKTA 层析系统购自美国GE 公司。

1.3 实验动物 SPF 级BALB／c 小鼠，雌性，体重18~20 g，6 ~ 8 周龄，由本公司动物室提供，动物合格证号为：SCXK（吉）-2019-0005。本实验对小鼠的所有处理均以科研为目的进行养殖和使用，且按照动物伦理相关规定进行。

1.4 引物的设计及合成 参考GenBank 中登录的IL-1R1 基因序列（XM_011511118.2），应用 Primer Premier 5.0 软件设计扩增IL-1R1 基因引物，IL-1R1-F：5′-GACATATGAAAGTGTTACTCAGACTTATT TGT-3′（下划线部分为 NdeⅠ位点），IL-1R1-R：5′-TCAAGCTTACTTCTGGAAATTAGTGACTGGAT-3（′下划线部分为HindⅢ位点），扩增产物大小为1 700 bp；IL-1R1-CS-F：5′-TAAAAGACAAGGCCTTCTCCAA-3′，IL-1R1-CS-R∶5′-CACCTAAAGAACTCTTGGCAACT-3′，扩增产物大小为1 767 bp。引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.5 目的基因的扩增 用RNA 提取试剂盒提取A375·S2 细胞RNA，逆转录合成cDNA，以其为模板，IL-1R1-CS-F ／ IL-1R1-CS-R 为引物进行第 1 轮 PCR扩增。PCR 反应条件为；95 ℃预变性 2 min；95 ℃变性 20 s，55 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 30 s，共 35 个循环；72 ℃再延伸10 min。以第1 轮扩增产物为模板，IL-1R1-F ／ IL-1R1-R 为引物进行第 2 轮 PCR 扩增。PCR 反应条件同上。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6 重组表达质粒的构建 纯化回收目的基因，与载体pET-28a 均经NdeⅠ和HindⅢ双酶切，回收目的基因及载体片段，以T4 DNA 连接酶于16 ℃连接过夜；连接产物涂布于含50 μg ／ mL 卡那霉素的LB平板，于37 ℃培养16 h；挑取单克隆，转化感受态E.coli DH5α，于 37 ℃经 50 μg ／ mL 卡那霉素选择培养16 h；挑取单克隆，进行菌落PCR 鉴定，将鉴定正确的重组质粒送吉林省库美生物科技有限公司测序，测序正确的重组质粒命名为pET-28a-IL-1R1。

1.7 目的蛋白的诱导表达 将重组表达质粒pET-28a-IL-1R1 转化至感受态 OverExpress（DE3），涂布于含 50 μg ／ mL 卡那霉素的 LB 平板，37 ℃培养 16 h；挑取单克隆，于含 50 μg ／ mL 卡那霉素的 LB 液体培养基中培养至A600为0.6 ~ 0.8 时，加入终浓度为 1 mmol ／ L 的 IPTG，于 37 ℃，200 r ／ min 诱导 5 h。取全菌体，经10% SDS-PAGE 分离蛋白，转移至NC膜上，于4 ℃用10%血清的PBS 封闭12 h；加入鼠抗His 标签单克隆抗体（1 ∶8 000 稀释），37 ℃孵育 1 h；加入 HRP 标记的羊抗鼠 IgG（1 ∶8 000 稀释），37 ℃孵育 45 min；DAB 显色。

1.8 目的蛋白的纯化及鉴定 表达菌于10 ℃，8 000 × g 离心 30 min，收集菌体，用 1 ∶10（W ／ V）的缓冲液（50 mmol ／ L Tris-HCl，pH 8.0）重悬，经高压均质机 800 bar 均质 3 次后，于 4 ℃，8 000 × g 离心30 min；收集包涵体，用 100 mL 的变性液（50 mmol／L Tris-HCl，8 mol ／ L 尿素，300 mmol ／ L KCl，pH 8.0）重悬，于 4 ℃放置 12 h；经 0.45 μm 的滤膜抽滤。用3 个柱体积的变性液平衡镍离子亲和层析柱，将变性的包涵体上样，分别用不同浓度的洗脱液（含20、50、100、300 mmol ／ L 咪唑的变性液）除去杂蛋白并收集目的蛋白。将目的蛋白用透析袋包裹，并浸泡于复性液（50 mmol／L Tris-HCl，2 mmol／L GSH，0.2 mmol／L GSSH，0.5 mol ／L L-Arg，pH 7.5）中透析 4 h；于 4 ℃缓冲液中透析过夜。复性后的目的蛋白经12% SDSPAGE 分离后，进行 Western blot 检测（方法同1.7 项）。

1.9 动物免疫 将纯化后的目的蛋白IL-1R1 与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化，抗原的终浓度均为 1 mg ／ mL。经腹腔免疫 10 只 BALB ／ c 小鼠，100 μL ／只；首次免疫后 1、2、3 周，将纯化后的目的蛋白IL-1R1 与等体积的弗氏不完全佐剂混合，免疫小鼠，免疫剂量及途径同上。首次免疫后4 周，经眼缘静脉丛采血，分离血清。同时设阴性对照组（仅免疫佐剂）。

1.10 免疫原性检测

1.10.1 血清抗体效价检测 采用间接ELISA 法。用纯化后的 IL-1R1 蛋白按 0.3 μg ／ 孔包被 96 孔板，4 ℃包被 18 h；加入含 10%血清的 PBS，100 μL ／ 孔，4 ℃封闭24 h；加入待测免疫血清及阴性对照血清（均按 1 ∶10 稀释）,100 μL ／ 孔，37 ℃孵育 1 h，同时设空白对照；用PBST 洗涤3 次，加入HRP 标记的羊抗鼠IgG（1 ∶8 000 稀释），100 μL ／ 孔，37 ℃孵育 1 h；PBST 洗涤 5 次，加入四甲基联苯胺底物，50 μL ／ 孔，37 ℃孵育 15 min；2 mol ／ L 浓硫酸终止反应，用酶标仪检测A450值。以阴性孔A450值 × 2.1 为Cut off值，大于Cut off 值的最大稀释度为效价。

1.10.2 Western blot 分析 A375·S2 细胞密度达1 × 106个 ／ mL 时，弃细胞培养液，用 PBS 洗涤 1 次，0.25%胰酶消化，3 000 × g 离心 10 min，用细胞裂解液将重悬沉淀。将细胞裂解液及重组IL-1R1 蛋白分别经10% SDS-PAGE 分离后，转移至NC 膜上，加入免疫小鼠血清，同时以鼠抗IL-1R1 多克隆抗体作为阳性对照，未免疫过的小鼠血清作为阴性对照（均为1 ∶5 000 稀释），其他步骤同 1.7 项。

1.10.3 间接免疫荧光检测 将A375·S2 细胞于24 孔板中培养2 d，待融合度约达70%时，弃上清，用PBS 洗涤1 次，加入4%的多聚甲醛，室温固定20 min；用含10%血清的PBS 封闭20 min；加入免疫后的小鼠血清，同时设阴性对照组（仅免疫佐剂）、空白对照组（含10%血清的PBS）及阳性对照组（鼠抗IL-1R1多克隆抗体），血清均为1 ∶5 000 稀释，室温孵育1 h；PBS 洗涤 3 次，加入 FITC 标记的羊抗鼠 IgG（1 ∶100稀释），室温避光孵育1 h；PBS 洗涤3 次，加入 DAPI（1 ∶1 000 稀释），室温静置 5 min，弃 DAPI，PBS 洗涤1 次，立即在荧光显微镜下观察。

1.11 统计学分析 应用SPSS 19.0 统计学软件进行统计分析，ELISA 检测数据采用均值 ± 标准差（）表示，组间比较采用 t 检验，以 P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 目的基因扩增产物的鉴定 IL-1R1 基因的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见约1 000 bp 的目的基因条带，大小与预期相符，见图1。

图1 IL-1R1 基因PCR 产物电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of IL-1R1 gene

2.2 重组表达质粒的鉴定 重组菌PCR 产物经1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，1、2、3、5 号菌落呈阳性，可见约1 000 bp 的目的基因条带，大小与理论相符，见图2。1 号菌落测序结果表明，目的基因与GenBank登录的序列一致。证明重组表达质粒pET-28a-IL-1R1 构建正确。

图2 重组菌的菌落PCR 鉴定Fig.2 Identification of recombinant colonies of pET-28a-IL-1R1 by PCR

2.3 表达产物的鉴定 重组蛋白的相对分子质量约37 000，大小与预期相符，表达量约为总蛋白的18%，见图3。重组蛋白可与His 标签发生特异性结合，且于相对分子质量约37 000 处可见特异性结合条带，大小与预期相符，见图4。

图3 IL-1R1 蛋白表达产物的SDS-PAGE 分析Fig.3 Analysis of IL-1R1 protein expression by SDS-PAGE

图4 IL-1R1 蛋白表达产物的Western blot 分析Fig.4 Analysis of IL-1R1 protein expression by Western blot

2.4 纯化产物的鉴定 100 mmol ／ L 咪唑的洗脱峰含有大量目的蛋白，见图5。纯化的IL-1R1 蛋白相对分子质量约37 000，大小与预期相符，且条带专一，纯度约达93%，见图6。纯化的IL-1R1 蛋白可与His标签发生特异性结合，且于相对分子质量约37 000 处可见特异性结合条带，大小与预期相符，见图7。

图5 亲和层析的洗脱图谱Fig.5 Diagram of affinity chromatography elution curve

图6 纯化产物的SDS-PAGE 分析Fig.6 Analysis of purified IL-R1 protein by SDS-PAGE

图7 纯化产物的Western blot 鉴定Fig.7 Identification of purified IL-1 protein by Western blot

2.5 免疫原性

2.5.1 血清抗体效价 免疫后小鼠血清抗体效价约为 1 ∶100 000，阴性对照组约为 1 ∶100，空白对照组为0。与空白对照组比较，免疫后小鼠血清效价明显升高（t < 0.001，P < 0.001）。

2.5.2 Western blot 分析 免疫后小鼠血清及阳性对照血清均可与重组IL-1R1 蛋白及A375·S2 细胞中受体蛋白发生特异性结合，且于相对分子质量约35 000 处可见特异性结合条带，大小与预期相符；阴性对照组未见该条带。见图8。

图8 免疫后血清的Western blot 鉴定Fig.8 Identification of serum by Western blot

2.5.3 间接免疫荧光检测 免疫后小鼠血清及阳性对照血清均可与A375·S2 细胞表面IL-1R1 天然受体发生特异性结合，可见较强荧光；阴性对照组产生较弱荧光；空白对照组未见荧光。见图9。

图9 间接免疫荧光检测的镜下观察（× 400）Fig.9 Indirect immunofluorescence assay（× 400）

3 讨 论

IL-1R1 共含570 个氨基酸，包括胞外域336 个氨基酸，单次跨膜区20 个氨基酸及胞内214 个氨基酸，其中胞外域含有3 个免疫球蛋白样结构域，是与IL-1 结合的主要部位，两者结合后在IL-1R1 AcP的作用下进行细胞信号的转导［9］。天然状态下的IL-1R1 存在5 个糖基化位点，理论相对分子质量约62 000，实际相对分子质量约 80 000［10-11］，本研究表达的胞外域蛋白不含糖基化位点，理论相对分子质量约37 000。人体几乎所有的细胞均表达IL-1R1，A375·S2 细胞是IL-1Ra 活性检测最常用的细胞，其IL-1R1 表达量较高，对IL-1 较敏感。原核表达IL-1R1胞外域理论上能够将IL-1R1 的关键表位暴露出来，但由于翻译后修饰与真核表达不同，其生物学活性有待检测，尤其是蛋白表达以包涵体的形式存在，因此复性条件对蛋白结构的影响较大［12］。本研究经与商品化多抗对比实验证实，重组IL-1R1 免疫小鼠后血清与商品化多抗的结合能力相同。

IL-1 不仅与炎症反应、机体应激等有关，还参与类风湿关节炎、痛风、神经退行性疾病、子宫内膜异位症及多种炎性罕见疾病的发病及调节多种免疫细胞的生成［13-14］。而 IL-1R1 作为IL-1 生物学效应的关键靶点，与这些疾病的发生密切相关。2001 年，FDA 批准了Amgen 公司研发的重组IL-1R 拮抗剂Anakinra 用于类风湿关节炎的治疗，目前该产品在美国、欧洲已获批治疗包括类风湿性关节炎、CAPS 及成人Still 病等多种罕见疾病适应症［15-16］。与IL-1R拮抗剂作用类似，卡那单抗通过与IL-1 结合，竞争性抑制IL-1 与IL-1R1 受体蛋白结合，进而能够有效阻断该信号通路的转导，从而为多种疾病的治疗提供新的方向［17-18］。

本研究结果显示，经重组表达的IL-1R1 胞外域蛋白免疫小鼠后，其多克隆抗体能与IL-1R1 发生特异性反应，表明该重组蛋白能够将部分抗原表位呈现出来，间接免疫荧光法检测结果证实，该多克隆抗体能够与细胞表面天然受体结合，有可能阻断信号转导，为后续单克隆抗体的筛选及后续细胞受体功能研究奠定了基础。