褪黑素对内蒙古绒山羊毛囊干细胞增殖和迁移的影响及机制探讨*

严其高，祁冰洁，刘慧娟，刘金林，刘 毅

(安庆医药高等专科学校教务处，安徽 安庆 246052)

毛囊的周期发育过程是一个复杂的生理调控网络，受到大量的细胞因子以及细胞信号通路的相关因子的调控及影响[1]。据报道，体内的内分泌激素、机体的营养状态、环境因素等均参与了毛囊周期性发育过程[2]。褪黑素最初是Lerner于1958年首次从牛的松果体中分离出来后被发现，目前得到证实的是，褪黑素由生物体的松果体分泌，本质上属于吲哚类的神经内分泌性激素及抗氧化剂，能够刺激毛囊干细胞向毛囊细胞分化，促进其增殖及迁移[3]。为了进一步探索褪黑素对毛囊干细胞的影响以及相关机制，本研究探讨褪黑素是否能够通过激活典型的Wnt/β-catenin通路促进毛囊干细胞的增殖与迁移，从而进一步明确毛囊干细胞的有效调控物质和相关信号通路。

1 材料与方法

1.1材料 细胞：来自内蒙古自治区生物制造重点实验室分离纯化的内蒙古绒山羊毛囊干细胞所建立的P3代绒山羊毛囊干细胞系。试剂：高糖DMEM培养基、10 %胎牛血清、胰蛋白酶购于美国Gibco公司，褪黑素购于美国Sigma公司，IWR-1(Wnt/β-catenin信号通路抑制剂)购于美国MedChemExpresss公司，CCK8实验试剂盒购于上海生工有限公司，Transwell细胞迁移实验试剂盒购于美国eBscience公司，Western-blot试剂盒购于美国Sigma公司，β-连环蛋白(β-catenin)、淋巴细胞增强结合因子1(Lymphoid Enhancer-binding Factor-1，LEF-1)蛋白一抗购于美国Santa Cruz Biotechnology公司。仪器：超净工作台(HEAR GU ARD ECO，苏州净化设备厂)；蛋白电泳仪、转膜仪购于BIO-RAD公司；紫外分光光度计购于上海仪天科学仪器有限公司。

1.2细胞培养及分组 将P3代内蒙古绒山羊毛囊干细胞置于37 ℃、5 %CO2细胞培养箱中，当细胞生长到60 %～70 %汇合时，应用0.25 %胰蛋白酶将细胞消化为单细胞悬液，加入24孔板中，每孔1×104个细胞接种。置于37 ℃、5 %CO2细胞培养箱中培养，当细胞生长贴壁后进行分组。

分为空白对照组、褪黑素干预A组、褪黑素干预B组、褪黑素干预C组、IWR-1组、褪黑素+IWR-1组。空白对照组未作处理，其余各组分别加入100 pg/mL褪黑素(20 μL)、300 pg/mL褪黑素(20 μL)、500 pg/mL褪黑素(20 μL)、IWR-1(20 μL)、300 pg/mL褪黑素(10 μL)与IWR-1的混合物(10 μL)，室温处理1 h。

1.3细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK8)实验 利用CCK8实验检测褪黑素对内蒙古绒山羊毛囊干细胞增殖活性的影响。收集各组对数生长期内蒙古绒山羊毛囊干细胞，将1×104个细胞接种于96孔板中，分别于接种后24 h向各孔中加入CCK-8溶液，37℃培养24 h，振荡混匀，酶标仪上读取450 nm波长处吸光光度值(OD)。根据以下公式计算细胞活力值。实验重复3次。

细胞活力(%)=[A(处理组)-A(空白组)]/[A(未处理组)-A(空白组)]×100 %。处理组加入细胞、实验试剂和干预药物；空白组仅加入实验试剂；未处理组加入细胞和实验试剂。

1.4Transwell细胞迁移实验 利用Transwell细胞迁移实验检测褪黑素对内蒙古绒山羊毛囊干细胞迁移的影响。收集各组对数生长期内蒙古绒山羊毛囊干细胞，调整细胞浓度为1.5×108/L，将各组150 μL细胞悬液接种于Transwell小室，37℃、5 %CO2细胞培养箱中培养20 h；后经多聚甲醛固定、磷酸盐缓冲液清洗、显微镜观察进行细胞计数。实验重复3次。

1.5Western-blot检测LEF-1、β-catenin蛋白表达 各组细胞使用含有PMSF的RIPA裂解液进行裂解，离心(12 000 r/min，15 min)后取上清液，经Western Blot法检测各组LEF-1、β-catenin蛋白表达量。应用Gel-ProAnalyzer成像系统进行灰度值分析。实验重复3次。

2 结果

2.1褪黑素对内蒙古绒山羊毛囊干细胞增殖活性的影响 褪黑素干预各组的细胞活力值均显著高于空白对照组(P<0.05)。伴随褪黑素浓度的增加，细胞活力值有显著升高趋势。经统计，褪黑素干预B组、C组的细胞活力值显著高于褪黑素干预A组(P<0.05)；褪黑素干预C组的细胞活力值显著高于褪黑素干预B组(P<0.05)。见表1。

表1 CCK8细胞增殖实验获取的细胞活力值

2.2褪黑素对内蒙古绒山羊毛囊干细胞迁移的影响 褪黑素干预各组的迁移细胞数目均显著高于空白对照组(P<0.05)。伴随褪黑素浓度的增加，迁移细胞数目有显著增加的趋势。经统计，褪黑素干预B组、C组的迁移细胞数目显著高于褪黑素干预A组(P<0.05)；褪黑素干预C组的迁移细胞数目与褪黑素干预B组比较差异无明显统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 Transwell细胞迁移实验

2.3Wnt/β-catenin信号通路对内蒙古绒山羊毛囊干细胞增殖及迁移的影响 褪黑素干预组的细胞活力值、迁移细胞数目均显著高于空白对照组(P<0.05)。IWR-1组的细胞活力值、迁移细胞数目均显著低于褪黑素干预组(P<0.05)。褪黑素+IWR-1组的细胞活力值、迁移细胞数目均显著高于IWR-1组(P<0.05)。见表3、4。

表3 Wnt/β-catenin信号通路对内蒙古绒山羊毛囊干细胞增殖的影响

2.4Western-blot检测各组Wnt/β-catenin信号通路的活性 结果显示，褪黑素干预组的β-catenin蛋白、LEF-1蛋白的相对表达量明显高于空白对照组(P<0.05)。IWR-1组的β-catenin蛋白、LEF-1蛋白的相对表达量显著低于褪黑素干预组(P<0.05)。褪黑素+IWR-1组的β-catenin蛋白、LEF-1蛋白的相对表达量显著高于IWR-1组(P<0.05)。见表5、图1和表6、图2。

图2 Western-blot检测各组LEF-1蛋白表达

表4 Wnt/β-catenin信号通路对内蒙古绒山羊毛囊干细胞迁移的影响

表5 Western-blot检测各组β-catenin蛋白相对表达量

表6 Western-blot检测各组LEF-1蛋白相对表达量

图1 Western-blot检测各组β-catenin蛋白表达

3 讨论

毛囊干细胞是具有自我更新能力和多向分化潜能的毛囊细胞，是毛囊组织中的原始性细胞，体外克隆形成的能力较强[4]。一直以来，毛囊干细胞的表面标志物、受调控的信号通路、影响生长调控的激素及路径等为该领域研究的热点[5]。Wnt/β-catenin信号传导通路是最早被发现和研究、参与到各类干细胞调控中的信号通路，其在维持干细胞的生长中发挥重要作用[6]。在干细胞增殖分化的过程中，Wnt/β-catenin通路中的Wnt蛋白能够阻止β-catenin的水解过程，因此细胞质中的β-catenin将达到一定的浓度，并转移至细胞核中，进一步与细胞核中的转录因子形成复合物，通过转录效应激活下游靶基因[7]。在高水平β-catenin蛋白的作用下，毛囊干细胞活化后分化为毛发[2]。淋巴样增强因子(LEF)在Wnt/β-catenin通路中能够与T细胞转录因子结合形成转录复合体，对相应基因的转录发挥调控作用[8]。

直至1993年，褪黑素在抗氧化、延缓衰老、优化睡眠方面的生物学作用才引起科学界的重视[9]。目前，褪黑素及其衍生物在人体生理学、药理学和临床医学领域中的研究为医学界的前沿课题[10]。有研究报道，褪黑素能够激活Wnt/β-catenin通路，促进周围神经损伤的修复机制，发挥延缓神经系统衰老的作用[11]。也有研究报道，Wnt/β-catenin通路对毛囊干细胞的增殖与分化发挥明显的调控作用[12]。

本研究结果显示，在一定浓度的褪黑素干预下，内蒙古绒山羊毛囊干细胞的增殖活性和迁移能力显著增加。当褪黑素的浓度为300～500 pg/mL时，内蒙古绒山羊毛囊干细胞增殖活性最高，细胞发生迁移的数量最多。说明褪黑素能够刺激体外培养的毛囊干细胞的增殖，而细胞的迁移能力也在客观上反映了细胞的增殖状态，但其对毛囊干细胞的具体作用机制尚不完全清楚。为了进一步探索褪黑素对毛囊干细胞的具体作用机制，本研究进一步增设了IWR-1组、褪黑素+IWR-1组，观察在Wnt/β-catenin被阻断后的情况下，内蒙古绒山羊毛囊干细胞的增殖及迁移情况。IWR-1为Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂，经IWR-1干预后，毛囊干细胞的增殖及迁移情况明显受到抑制。而在褪黑素与IWR-1同时作用于内蒙古绒山羊毛囊干细胞的情况下，细胞的活力值及迁移细胞数目明显高于IWR-1单纯干预组。以上结果证实了Wnt/β-catenin信号在内蒙古绒山羊毛囊干细胞的增殖与分化中的必要性，也证实了一定浓度的褪黑素对内蒙古绒山羊毛囊干细胞的增殖活性和迁移能力的促进作用，但尚不能说明褪黑素是否通过激活Wnt/β-catenin信号通路来发挥以上作用。后续的Western-blot检测结果发现，在褪黑素的干预下，Wnt/β-catenin信号通路激活状态标志物(β-catenin蛋白、LEF-1蛋白)的表达量显著高于空白对照组，证明了褪黑素干预有效激活Wnt/β-catenin信号通路的情况。随后的研究中，IWR-1的干预明显降低了毛囊干细胞中β-catenin蛋白、LEF-1蛋白的相对表达量，说明Wnt/β-catenin信号被阻断后相应的激活蛋白标志物的水平也明显减低。然而，当一定浓度的褪黑素及IWR-1同时作用于毛囊干细胞时，β-catenin蛋白、LEF-1蛋白的相对表达量有所增加，更进一步证实了褪黑素能够通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进毛囊干细胞增殖及迁移的生物学活性。

本研究通过体外实验进一步阐明了一定浓度的褪黑素可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路来促进内蒙古绒山羊毛囊干细胞生物学活性的相关作用，丰富了临床关于褪黑素的生理学、药理学机制研究的理论基础，在后续的研究中尚需要进一步阐明其他信号通路在褪黑素调控内蒙古绒山羊毛囊干细胞生物学活性中的作用及相关机制。