基于网络药理学探讨振中汤治疗类风湿关节炎作用机制*

张尚祖，陈 琰，冒 锐，张鹏程，张宏伟，马吾生，张利英，，3，刘永琦，3

(1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省心血管病研究所；3.甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究重点实验室)

类风湿关节炎(rheumatic arthritis,RA)是一种主要表现为侵蚀性、对称性关节炎的慢性、全身性自身免疫疾病[1]。其基本病理改变为关节慢性滑膜炎症，逐步发展出现软骨基质和骨破坏，最终导致关节形状、功能丧失[2]。据报道，全球范围内RA发病率呈上升趋势，我国患病率约0.4 %，多见于中年女性[3]。目前，指南多推荐甲氨蝶呤作为临床首选药物，但其起效慢、疗程长，部分患者表现胃肠道反应、肝损害等多种不耐受[4]。以TNF-α拮抗剂为代表的生物靶向制剂对近半数患者并不敏感，长期使用可能增加结核、肿瘤风险，再加上其高昂的价格和治疗的长周期性都限制了临床使用[5]。中医将该病归于“痹证”探讨，成书于春秋战国的《素问》已有专篇论述，形成了风、寒、湿三邪夹杂，致肢体经络气血运行不畅，瘀血痰浊痹阻关节的基本病因病机认识，后经各大医家接续发展，建立了系统的辨治体系，创立了大量常用验方。中医治疗RA具有获效快、不良反应少等特点，结合现代研究进展，开发了雷公藤多苷片等多种良效中药制剂，并随着网络药理学发展中药复方研究进一步获得关注。

振中汤源于《医学衷中参西录》，主腿疼、腰疼，饮食减少者。方重用白术，一取其主风寒湿痹之意；二取其健补脾胃以旁达关节之功；陈皮、厚朴共主中焦，以辛苦之味入脾胃经脉，行气燥湿，除无形之痰湿；乳香、没药二味，入心肝脾经，气血同治，解肢体痹痛。有健补脾胃、通活气血之功，善治风寒湿痹。网络药理学利用网络生物学及生物信息学技术，全面揭示疾病的发展过程和药物与机体的相互作用，为中药复方多层次系统研究提供了方法[6]。本研究基于网络药理学探讨振中汤治疗RA的主要有效化合物、作用靶点、作用通路，旨在为研究振中汤治疗RA的具体作用机制提供研究思路，为其临床上更广泛的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1振中汤有效成分及靶点筛选 基于中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)[7]搜集振中汤中白术、当归、陈皮、乳香、没药、厚朴的化合物，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥ 30 % 和类药性(drug-likeness，DL)≥ 0.18 筛选出振中汤有效成分，通过Uniport数据库(http://www.uniprot.org/)[8]将振中汤有效成分蛋白名转化为基因名。

1.2振中汤有效成分-靶点网络构建 将筛选所获药物有效成分和经Uniprot数据库验证的靶点信息,构建成作图节点信息导入Cytoscape3.8.2[9],构建振中汤有效成分-靶点网络。

1.3类风湿关节炎靶点获取 通过Drugbank数据库(http：//www.drugbank.ca/)[10]和Genecard数据库(http：//www.genecards.org/)[11]以“rheumatic arthritis”“RA”为关键词检索RA相关疾病靶点，并使用Uniprot数据库进行规范。

1.4关键靶点筛选及构建蛋白作用网络 应用Venny2.1在线平台(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)将振中汤有效成分靶点和RA相关的疾病靶点建立映射构建韦恩图。获得交集的可能是振中汤有效成分治疗RA的关键靶点。将交集共同靶点输入String11.0数据库(https：//string-db.org/)[12]构建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络。

1.5关键靶点基因功能注释和通路富集分析 应用 WebGestalt 富集分析工具(http：//www.webgestalt.org)[13]，选择ORA Sample Run数据入口，使用ORA算法，选择pathway注释数据来源和KEGG数据库，输入交集共同靶点，设置genome protein-coding为参考基因集，进行基因本体(Gene Ontology，GO)[14]功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)[15]通路富集分析，保留P≤0.05 的结果进行可视化处理，进一步分析振中汤治疗RA潜在的生物过程和信号通路。

2 结果

2.1振中汤有效成分-作用靶点网络构建 本次研究在TCMSP数据库中共筛选振中汤有效成分53个，其中白术4个，当归2个，陈皮5个，乳香6个，没药34个，厚朴2个，去除2个重复有效成分，共计51个有效成分纳入研究。将所获有效成分蛋白名经Uniport数据库转换去重后共得到234个靶点基因信息。将上述数据导入构建作图文件后导入Cytoscape3.8.2进行可视化分析。见表1、图1。

图1 振中汤有效成分靶点网络

表1 振中汤成分信息

2.2RA疾病靶点的筛选及共同靶点PPI网络构建 通过Drugbank和Genecard数据库检索疾病靶点信息，并删除重复项，获得RA相关基因1 223个。将1223个疾病基因与234个振中汤有效成分靶点基因信息录入Venny2.1取交集后获得了120个疾病-有效成分共同靶点，所得共同靶点在振中汤治疗RA中具有重要作用。将120个共同靶点录入String11.0数据平台构建PPI网络，只选取评分值 > 0.9的最高置信度数据，获得一个120个节点、429条边、平均度值为7.15的网络图，其节点边越多则该节点在PPI网络中越重要。将该网络tsv格式导入Cytoscape进行可视化化分析，利用Analyze Network插件，选择degree二倍中位数筛选，获得25个关键靶点基因PPI示图，依据度值设置节点大小，由振中汤治疗RA关键靶点PPI网络图可见，原癌基因(JUN)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、白细胞介素-6(IL6)、蛋白激酶B1(ATK1)、B细胞k轻肽基因增强子核因子3(RELA)、肿瘤蛋白P53(TP53)、即早基因(FOS)、白细胞介素-8(CXCL8)、雌激素受体1(ESR1)、myc基因(MYC)、信号转导与转录激活因子1(STAT1)、B细胞k轻肽基因增强子核因子抑制因子(NFKBIA)等25个靶基因可能是振中汤与RA产生作用的关键靶点。见图2、3、4。

图2 振中汤(ZZT)有效成分靶点与RA靶点韦恩图

图3 振中汤治疗RA的PPI网络

图4 振中汤治疗RA关键靶点PPI网络

2.3关键靶点GO生物功能注释 用 WebGestalt 富集分析工具,设置P值 ≤0.05,P值越小，富集程度越高。对振中汤有效成分靶点-RA靶点的120个交集靶基因进行GO生物功能注释，共获取到119个生物进程，预测靶基因代谢途径(BP)主要富集于刺激反应(response to stimulus)、生物调节(biological regulation)、代谢过程(metabolic process)等；振中汤调控的细胞成分(CC)为膜区(membrane)、腔上包膜membrane-enclosed lumen)、细胞溶质(cytosol)等；分子功能(MF)涉及蛋白质结合(protein binding)、离子结合(ion binding)、核酸结合(nucleic acid binding)等方面。这表明振中汤多种成分可以通过调节机体对刺激的应答反应、生物物质代谢等途径，作用于细胞各层结构组织和各种人体内物质的结合过程，以维持机体内环境的稳定从而发挥对RA的治疗作用。见图5。

图5 振中汤靶点基因GO分析条形图

2.4KEGG通路富集分析 用 WebGestalt 富集分析工具对振中汤有效成分靶点-RA靶点的120个交集靶蛋白进行KEGG富集通路分析，设置P值 ≤ 0.05，共包括104条信号通路，取P值最小的前20条通路，导入在线平台omicshare(https：//www.omicshare.com)绘制P值颜色梯度富集条形图。视图可见，共同靶点主要富集于TNF信号通路、AGE-RAGE信号通路、白介素-17信号通路、Th17细胞分化、Toll样受体信号通路、内分泌抵抗、破骨细胞分化、HIF-1信号通路等20条通路上。见图6。

图6 振中汤靶点基因 KEGG富集条形图

3 讨论

3.1振中汤治疗RA有效成分分析 张锡纯所著《医学衷中参西录》一书，结合张氏熟读医史之通悟和数十载临床经验，对具体药物使用推陈出新，临床注重滋补后天脾胃，调畅一身气机，处方用药简明有效，为后世医家所喜。振中汤虽主腰腿疼痛，但白术独重是为主“痹证”之意，配伍它药气血同调，使人体气机得畅，有形无形之痰瘀皆可得去，体现了张氏临床之精妙。药理学研究表明白术含挥发油、倍半萜类酯化合物具有促进营养物质吸收、调节胃肠道功能、抗衰老、抗感染、抗肿瘤等作用[16]；当归含β-谷甾醇、豆甾醇，具有促进血细胞生成、增强机体免疫、抑制炎症后期肉芽组织增生、抗血栓、抗肿瘤、抗感染等作用[17]；陈皮含黄酮类、生物碱类等成分，具有抗血小板凝集、抗氧化、抗衰老、抗过敏、抗肿瘤等作用[18]；乳香含甘遂醇、乳香脂酸等物质，具有镇痛、抗炎消肿、广谱抗菌、抗氧化、降低血小板黏稠性、抗肿瘤等作用[19]；没药含槲皮素、没食子酸、花葵素等成分，具有降脂、镇痛、消炎抗菌、抗肿瘤等作用[20]；厚朴含桉叶油醇、新橙皮苷，具有抑菌、松弛肌肉、调节胃肠功能、降压等作用[21]。

3.2振中汤治疗RA的关键靶点分析 通过韦恩图获得药物疾病共同靶点，通过PPI分析，Cytoscape对关键靶点进行筛选，可发现JUN、TNF、MAPK3、IL6、ATK1、NFKBIA等25个靶点对振中汤治疗RA发挥关键作用，对Degree前十的关键靶点进行分析。RA患者穿刺标本中可见原癌基因(JUN)中fos、ras表达增高，并且JUN可与TNF-、CREB等多种基因转录因子结合，诱导增生滑膜细胞凋亡[22-23]。动物实验发现，肿瘤坏死因子(TNF)表达越高，关节肿胀程度越重[24]，TNF参与RA炎症过程和骨细胞增殖和分化并介导多种白细胞介素生成，可控制炎症反应过程和直接杀伤或抑制RA相关细胞增殖[25-26]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)系列通路成分，参与细胞生理过程和炎症反应等病理过程，且能够促进IL、TNF表达[27]，在RA病理过程中发挥重要作用。IL是RA病理过程的一种关键炎症细胞因子，RA患者血液学检测中白介素(IL)家族水平明显增高，IL可通过刺激大量自身抗体生成、刺激血管内皮增殖，诱导关节组织炎症反应和骨细胞破坏，致使RA全身及局部症状[28-29]。蛋白激酶B1(ATK1)，在细胞凋亡，糖代谢，蛋白质合成中具有重要作用，参与RA滑膜成纤维细胞生成[30]。B细胞k轻肽基因增强子核因子3(RELA)是NFκB 转录因子信号通路中的关键蛋白[31]，它可能在RA炎症应答、介导相关信号传递、激活NFκB 转录因子等方面发挥作用。肿瘤蛋白P53(TP53)是细胞染色DNA的正常组成成分，具有重要的生理功能，在多种疾病中发挥重要作用，其被认为参与RA滑膜细胞增殖和骨破坏[32]，即早基因(FOS)可能通过参与机体多种细胞信号、功能调节，在RA中发挥作用[33-34]。雌激素受体1(ESR1)是配体依赖的转录调节因子，其可能通过刺激破骨细胞成熟，成骨细胞凋亡，促进骨形成，抑制骨小梁和皮质内骨表面的骨吸收参与RA疾病过程[35]。目前认为myc基因(MYC)异常表达，参与了多种肿瘤进程，对于RA疾病过程调节可能与滑膜增生有关。

3.3振中汤治疗RA的关键通路分析 GO分析及KEGG通路富集结果显示，关键靶点主要富集在TNF信号通路、AGE-RAGE信号通路、白介素-17信号通路等20条通路上。振中汤-RA关键靶点基因JUN、TNF、MAPK、IL、NFκB都可以调控TNF信号通路，增加滑膜细胞异常表达炎症因子可能和促使滑膜细胞增生[36]。AGE-RAGE信号通路与RA关系缺少研究，但可能与AGEs含量与血管增生密切相关，AGEs与受体结合导致破骨、成骨细胞NF-kB途径失调，骨重建紊乱有关[37]。白介素-17可诱导滑膜细胞、软骨炎症因子和趋化因子的表达[38]，使大量免疫细胞到达炎症部位加剧机体的炎症反应，IL-17、IL-6、TNF、IL-I等靶点可调节白介素-17信号通路加重RA关节症状甚至直接损伤关节[39]。Th17因子由Th0细胞在IL-6和IL-23的刺激下分化而成的辅助性T细胞，主要分泌各种促炎症因子，与RA等自身免疫性疾病明显相关[40]，实验证明干预Th17细胞分化，可显著改善RA动物模型病情。Toll样受体信号通路可活化多种免疫细胞，启动非特异性、激活特异性免疫应答，在炎症反应、免疫细胞调控方面发挥着重要作用，实验表明RA炎症因子表达与其密切相关。尚缺乏RA内分泌抵抗信号通路相关研究，但雌激素的异常表达对RA有重要作用，可以推断雌激素抵抗可能导致骨关节结构、功能丧失。破骨细胞分化信号通路是维持骨功能、代谢的关键通路，RA患者骨代谢失衡，滑膜炎导致的骨侵蚀是其主要特征，NFκB途径是介导破骨细胞分化的重要调节途径[41]。HIF-1信号通路是机体细胞感知和反应氧气的重要过程，缺氧可直接调节VEGF(血管内皮生长因子)分化以促进血管生成，诱导p53蛋白的积累导致滑膜细胞增殖和骨破坏[42]。

综上所述，本研究采用网络药理学方法，挖掘振中汤中51种有效成分及234个潜在靶点,类风湿关节炎相关疾病靶点1 223个,其中振中汤-类风湿关节炎共同靶点120个，共同作用靶点主要富集于119个生物过程和104条信号通路上。振中汤临床治疗RA多用，但尚无针对其治疗机制的相关研究，运用网络药理学方法，可认为振中汤通过多靶点、多通路协调发挥治疗类风湿关节炎，JUN、TNF、MAPK3、IL6、ATK1、RELA等可能是此治疗过程的核心靶点，TNF信号通路、AGE-RAGE信号通路、白介素-17信号通路等为其主要作用通路，从而发挥抗炎、调节免疫、调节内分泌功能、抑制滑膜细胞增殖、减少破骨细胞生成、抗缺氧应激来治疗类风湿关节炎。但由于各种平台存在数据更新不及时、数据一致性较差等限制，振中汤治疗RA相关机制还需进一步实验验证。