离心分配色谱法对达乌里芯芭中毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的分离纯化

夏 莹，张明旭，秦 玲，高 冰,李旻辉,

(1.内蒙古自治区中医药研究所，内蒙古 呼和浩特 010020；2.包头医学院)

达乌里芯芭(Cymbaria dahurica L.)是一种多年生草本，别名芯芭、大黄花和白蒿茶，蒙名兴安奈-哈吞-额布斯，主要生于典型草原、荒漠草原和山地草原上，在内蒙古呼伦贝尔市、赤峰市、乌兰察布、包头市等地区广泛分布。达乌里芯芭是一种传统蒙药材，蒙药名为韩琴色日高，以全草入药，具有祛风湿、止血利尿等功效，主治风湿性关节炎、月经过多、吐血、肾炎水肿、黄水疮等病症[1]。

目前对于达乌里芯芭化学成分的研究主要集中于环烯醚萜等成分[2]。在课题组的前期研究中，首次发现达乌里芯芭中含有毛蕊花糖苷(Acteoside)和异毛蕊花糖苷(Isoacteoside)[3]，其化学结构式如图1所示。毛蕊花糖苷具有广泛的药理活性，如肾功能保护、免疫调节、抗氧化、抗细胞凋亡、抗高血压等作用[4]。异毛蕊花糖苷也在体内体外实验中展现出了防止神经紊乱和认知障碍等作用[5]。

图1 毛蕊花糖苷(Acteoside)和异毛蕊花糖苷(Isoacteoside)的化学结构式

离心分配色谱法(centrifugal partition chromatography, CPC)是现代逆流色谱法中的一种液-液分配色谱技术。物质分离的原理是基于其在两种不相容的溶液中不同的分配系数而实现的，其简单、重复性好、适合分离天然产物中活性成分的特性受到研究人员的青睐[6]。虽然在以往的研究中，已有对其他植物中毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的分离，如曹馨元等人使用中压柱色谱技术分离制备毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷单体[7]、常敬娟使用制备液相色谱分离了北美车前草中的毛蕊花糖苷[8]。而离心分配色谱可以实现更高的生产效率和更低的生产成本，对毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的开发具有重要意义。

本研究旨在探索一种使用离心分配色谱法对达乌里芯芭中的毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷进行分离纯化的方法，为进一步实现达乌里芯芭产业化的开发利用和毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的广泛应用提供途径。

1 材料与试剂

1.1药材来源 达乌里芯芭药材于2018年6月采集于内蒙古自治区锡林郭勒盟东乌珠穆沁旗贺斯格乌拉农牧场马希拉哈达。样品由包头医学院生药教研室张春红教授鉴定为玄参科(Scrophulariaceae)芯芭属(Cymbaria L.)的植物达乌里芯芭(Cymbaria daurica L.)。

1.2试剂与仪器 毛蕊花糖苷标准品(批号: HE141730198)、异毛蕊花糖苷标准品(批号: HA141444298)采购于成都普菲德生物技术有限公司；乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等试剂均为分析纯，甲醇和乙腈为色谱纯。十万分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；IKA RV 10型旋转蒸发仪(上海焓佩机电设备有限公司)；XJB-40-B型纯水仪(沈阳欣洁科技有限公司)；PLC 2050离心分配色谱设备(北京吉尔森科技有限公司)；UltiMate 3000型高效液相色谱仪(美国热电公司)；分液漏斗、烧杯等玻璃仪器产于四川属牛玻璃仪器有限公司。

2 方法与结果

2.1毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的提取 称取干燥达乌里芯芭全草1 450 g，将其粉碎成中细粉(过四号筛)。采用加热回流法，用70 %乙醇提取1 h(物料比1∶10)，静置冷却后过滤提取液。按照上述方法反复提取3次。合并提取液，使用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得到醇提取物粗浸膏362.5 g。将醇提取物粗浸膏加水溶解后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，各部分萃取液分别用旋转蒸发仪减压浓缩成浸膏，最终得到石油醚部位浸膏55.91 g，乙酸乙酯部位浸膏21.47 g，正丁醇部位浸膏110.77 g和水部位浸膏174.26 g。经高效液相色谱法检测，毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷主要存在于正丁醇部分。

2.2毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的分离 将乙酸乙酯、正丁醇和超纯水按照体积比4∶1∶5的比例充分混合，配备离心分配色谱溶剂系统[9]。溶剂系统在分液漏斗中静置过夜，取上相作为固定相，下相为流动相。将固定相和流动相分别在常温，80W的条件下，超声15 min除气泡备用。称取萃取得到的正丁醇浸膏样品101.3 mg溶解在10 mL下相中，经0.45 μm微孔滤膜过滤，作为样品备用。

高速离心分配色谱仪器设置为降相模式，以10 mL/min的流速和500 r/min的转速将固定相泵入色谱柱中；12 min后，调节流速为3 mL/min，转速为1500 r/min后再注入流动相，18 min达到平衡状态，即可进样。

将样品由进样阀注入，设定高速离心分配色谱仪器运转时间90 min，用紫外检测器在320 nm波长下检测，自动收集到样品管中(每管10 mL)。收集液均经高效液相色谱法(HPLC)鉴定，将组分相同部分进行合并。合并后的组分再次注入进样阀，高速离心分配色谱仪器设定运转时间90 min，用紫外检测器在320 nm波长下检测，自动收集到样品管中(每管10 mL)，收集液经高效液相色谱法(HPLC)鉴定，将相同部分合并。最终将合并液进行减压浓缩至干，得到目标化合物毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷,并计算得率。得率计算公式如下：

2.3结果 所得样品均为白色粉末，与标准品进行HPLC检测对比，样品1为毛蕊花糖苷4.41 mg，纯度为95.49 %, 得率为0.33 %；样品2为异毛蕊花糖苷0.89 mg，纯度为94.83 %，得率为0.07 %。如图2所示。

图2 毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷高效液相色谱图

3 讨论

苯乙醇苷类化合物毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷在自然界中分布广泛，可以从肉苁蓉、地黄等多种植物中提取分离得到[10-11]。这两种化合物均展现出多种药理作用且具有低毒，稳定性好的优点，但是传统的提取分离方法相对困难、繁琐，给其深入研究带来了很大困难。离心分配色谱法因其快速、高效、低浪费的特性，有助于化合物大量分离纯化时获得更大经济效益。因此将该种方法应用于芯芭中化合物的分离纯化，对于促进达乌里芯芭资源利用开发具有重要意义。本实验首次采用了一种离心分配色谱法对达乌里芯芭中毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷进行分离纯化且纯度较高。相比其他方法，该方法高效便捷，为达乌里芯芭药用植物的工业化发展提供一种途径。