固相萃取-光化学衍生法测定汉中面皮中的黄曲霉毒素B1

王蓓蓓，李春梅，李崇勇，任 婷，刘 欣

(1.汉中市食品药品监督检验检测中心，陕西 汉中 723000；2.陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000；3.城固县食品药品检验检测中心，陕西 城固 723200；4.西安市质量与标准化研究院，陕西 西安 710065)

黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)是目前已发现的20多种黄曲霉毒素中毒性和致癌性最大的一种，是由于其结构含有1个氧杂萘邻酮(香豆素)和1个双呋喃环，致癌性主要与香豆素结构有关，毒性主要与二呋喃环结构有关，其毒性约为氰化钾的10倍、砒霜的68倍，被世界卫生组织认定为IA级危险物，也是目前研究最广的一种毒素[1-2]。黄曲霉毒素极易污染玉米、花生、稻谷等粮油制品，在自然中存在最广泛[3]。为了保障食品安全，在国标《GB2716—2017食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》[4]中规定了AFB1的最大限量值不超过20 μg/kg。用于测定AFB1的方法主要有传统的高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)[5]、高效液相-串联质谱法[6]和快检法(酶联免疫法[7]和胶体金层析法[8])，还有新型的生物技术法(核酸适配体法[9]和电子鼻法[10])。

汉中市位于陕西省南部，汉中面皮是以大米为原料，经过浸泡、磨浆、蒸熟、切条，再配蔬菜和佐料的一种地方特色美食，冷热形态下均可食用，具有白薄、光滑、细嫩、柔韧、鲜香等特点，口感软糯，香辣味美，回味悠长，老少皆宜[11-22]。调查研究[12-14]表明，大米的真菌毒素污染虽并不严重，但也有一定比例的AFB1阳性率，而在目前的文献中尚未发现对汉中面皮中的AFB1进行测定的报道。陕西省《食品安全地方标准 凉皮、凉面DBS61/0011—2016》[15]中对于各类以小麦粉、大米为原料的米皮、面皮、凉皮等的各项指标做了明确的要求，其中规定AFB1的限量指标为“≤5.0 μg/kg”，检测方法的国家标准《食品中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法GB/T 18979—2003》已经被《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定GB5009.22—2016》[16]替代，按照标准要求操作，基质复杂、含量低的样品在上机测试前还需经过前处理，最常用的分离富集法有液液萃取法[17]、固相萃取法[18]、免疫亲和萃取法[19]，近年来免疫磁珠净化[20]逐渐成熟并得到了应用。

本研究采用固相萃取-免疫亲和柱法，结合HPLC-光化学柱后衍生法，建立一种前处理方法简单、污染小、灵敏度高的面皮中AFB1的测定方法，为相关检测和标准的建立提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

面皮样品20份：购于汉中市汉台区面皮店，每份不少于1 kg，采样后封存，低温保存，备检。AFB1标准溶液1 mg(Standord Chemicals LOT：PR190214-09)。甲醇(色谱纯，赛默飞)；吐温-20(分析纯，天津科密欧)；氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾(分析纯，成都科龙)。实验用水：符合《分析实验室用水规格和试验方法GB/T6682—2016》一级水的要求。

1.2 仪器和设备

水浴恒温振荡器(SHA-C，常州亿能实验仪器厂)，分析天平(ELB300，日本岛津)；氮吹仪(Auto EVA，睿科科技有限公司)；涡旋混合器(Lab dancer，德国IKA公司)；高效液相色谱仪(LC-20AD荧光检测器，日本岛津)；光化学衍生器(ToxinStar，月旭科技有限公司)；C18色谱柱(4.6×250 mm，5 μm，月旭科技有限公司)；黄曲霉毒素免疫亲和柱(美国Rome labs/3 mL)；MIlli-Q纯水机(Milli-Q Integral，美国密理博公司)。

1.3 方法

1.3.1 AFB1标准储备液配制

先将AFB1标准品用乙腈溶解，按浓度1 mg/mL配制成储备液，再吸取一定体积的储备液，用体积分数50%的甲醇水溶液稀释成为浓度100 ng/mL的使用液，临用前用流动相稀释成1、2、3、4、5、10 ng/mL的工作液。

1.3.2 试剂配制

甲醇水溶液(体积分数80%)：量取1600 mL甲醇和400 mL超纯水，混匀后超声脱气。

磷酸盐缓冲盐溶液(Phosphate Buffered Saline，PBS)：称取氯化钠8.0 g、磷酸氢二钠1.2 g、磷酸二氢钾0.2 g、氯化钾0.2 g，用900 mL超纯水溶解，盐酸调节至pH 7.4±0.1，加超纯水稀释至1000 mL。

1.3.3 液相色谱条件

流动相：甲醇-乙腈-水(体积比47∶3∶50)；进样量20 μL；检测器为荧光检测器串联光化学衍生器，检测波长为激发波长360 nm，发射波长440 nm；流速0.8 mL/min；柱温35 ℃；色谱柱为月旭C18色谱柱。

1.3.4 样品制备

购买样品先从冰箱取出，放至室温后，用高速粉碎机打碎，混合均匀后装密封袋中待测。

样品提取：称取5.0 g(精确至0.01 g)粉碎混合均匀样品于离心管中，加入体积分数80%的甲醇水溶液20 mL涡旋混合，摇床中震荡1 h，玻璃滤纸过滤，滤液备用。

样品净化：将免疫亲和柱取出恢复至室温，准确吸取2 mL滤液，加入25 mL的PBS溶液于25 mL注射器中，以速度3 mL/min匀速下滴，样液滴完后，用10 mL的超纯水淋洗亲和柱2次，最后用2 mL甲醇洗脱亲和柱，收集洗脱液，氮气吹干用流动相定容至1 mL，涡旋，过滤膜，装瓶上机检测。

1.3.5 方法的线性范围和检出限

吸取一定体积1.3.1中的AFB1使用液，用流动相配制成浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 ng/mL的标准工作溶液，在1.3.3色谱条件下测定，以AFB1浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，其线性关系和相关系数为y=29 136.8x+7 505.6，R2=0.998 9，线性范围为1.0～10.0 ng/mL，检出限为0.03 μg/kg，AFB1标准曲线图见图1，AFB1标准色谱图见图2。

图1 AFB1标准曲线图

图2 AFB1标准溶液(2 ng/mL)色谱图

2 结果分析

2.1 样品提取条件优化

分别对加标样品用甲醇水溶液(体积分数80%)稀释后，摇床振摇0.5、1、2、3 h后，提取后过滤，免疫亲和柱净化，经光化学衍生后HPLC测定其回收率，结果如图3所示。振摇0.5 h回收率较低，随着振摇时间的增加回收率逐渐升高，振摇1 h后样品回收率均大于80%，考虑成本和效率，本实验最终采用振摇时间1 h。样品净化过程中样液上柱量、洗脱方法依据不同厂家的产品说明严格规范操作，加标样品采用不同流速1、3、6 mL/min净化，结果在1、3 mL/min时的回收率均满足要求，6 mL/min速度较快、目标物损失大，回收率低。结合实验提取效果和速度，本实验采用净化流速3 mL/min，即可实现充分提取和最佳富集。

图3 振摇时间对提取结果的影响

2.2 流动相优化

本实验过程中流动相采用一定比例的甲醇水溶液，在甲醇水溶液体积分数50%时，AFB1能在低浓度时实现有效分离和高响应值，但是在此流动相条件下，AFB1出峰时间较晚(20 min左右)且液相色谱仪的泵压力较大(18 MPa)，因此在流动相中加入少量的乙腈，可以降低泵压力(13 MPa)，使出峰时间提前了8 min左右，提高了检验效率和色谱柱的使用寿命。对比谱图见图4和图5。

图4 甲醇-水(体积比1∶1)出峰时间

图5 甲醇-乙腈-水(体积比47∶3∶50)出峰时间

2.3 光化学衍生

反相液相色谱方法分析AFB1时反相洗脱中存在荧光淬灭效应，使的AFB1的检测灵敏度降低[21]，文献和标准中多采用三氟乙酸柱前衍生法、柱后碘(或溴)衍生法或者电化学衍生法来提高检测的灵敏度。本试验采用光化学衍生器串联HPLC解决了AFB1荧光淬灭的现象，提高了检测灵敏度。光化学衍生技术是利用紫外光的照射，使流动相光解出具有荧光特性的基团与AFB1反应，可生成荧光特性更强更稳定的物质[22]。光化学衍生器的衍生效果好，检测灵敏度高、操作过程中不接触有毒有害试剂，安全性高。图6和图7为衍生前后的色谱图。

图6 未衍生标准点色谱图

图7 光化学衍生后标准点色谱图

2.4 方法回收率和精密度

对添加了3个水平AFB1标准溶液的空白面皮样品进行加标回收实验，每个水平进行6次实验，由表1可知样品加标回收率为76.8%～88.2%，相对标准偏差为1.83%～3.27%，满足标准要求。

表1 空白样品加标回收率

2.5 面皮样品检测

对市场上不同店面的20份面皮样品进行检测，只在一份样品中检出微量AFB1，结果略高于检出限，远低于DBS61/0011—2016中“≤5.0 μg/kg”的要求，其余19份样品中均未检出AFB1，可见面皮是低风险产品，与大米和稻谷中的AFB1污染无相关性。由空白样品、加标样品、试剂空白色谱图(图8—图10)，可得出本方法的线性范围、检出限和加标回收率均满足GB5009.22—2016的要求。

图8 空白样品色谱图

图9 加标样品色谱图

图10 试剂空白色谱图

3 讨论

采用固相萃取-免疫亲和柱后光化学衍生-高效液相色谱法测定了汉中面皮的AFB1。该方法线性范围在1.0～10 ng/mL，相关系数为R2=0.998 9，检测限位0.03 μg/kg，在1、5、10 ng/mL水平下加标回收率为76.8%～88.2%，相对标准偏差为1.83%～3.27%。王志强[23]在用固相萃取-柱后衍生法测定食品中的黄曲霉毒素中得到4种毒素的回收率大于85%，相对标准偏差在3.87%～5.00%范围内；张惠贤等[3]也建立了固相萃取-HPLC荧光检测法测定谷物中的AFB1，对小麦和大米分别在低、中、高3个水平进行了加标实验，回收率大于78%，相对标准偏差低于7.2%。通过比较和实验表明本方法具有良好的精密度和灵敏度，前处理方法简单、准确，利于实验开展，适用于汉中面皮AFB1的检测要求，同时也为汉中面皮的监管和建立地方标准提供了参考。