Alicycliphilus denitrificans Ylb10的Cr(VI)还原性质研究

左 群， 吕育财， 宋婷薇， 郭金玲， 任立伟， 龚大春

(1. 湖北省生物酵素工程技术研究中心(三峡大学)，宜昌 443002；2. 中国轻工业功能酵母重点实验室(三峡大学)，宜昌 443002； 3. 三峡大学 生物与制药学院，宜昌 443002)

铬盐、皮革、印染以及电镀等涉及铬工业的发展造成土壤铬污染的事件逐渐增多，铬环境污染也越来越严重，逐渐威胁到人类的健康。Cr(VI)易溶于水，氧化性强，被列入致癌物质[1]，人体长期暴露于铬污染环境会引起神经系统、肝脏、肾脏等损害，皮肤接触可能导致过敏或遗传性基因缺陷[2]，而Cr(VI)对环境也具有持久性的危害。Cr(III)溶解性小，移动性弱，是人体和动物体所必需的微量元素，主要参与糖和脂肪的代谢过程[3]。

微生物法为铬(VI)污染土壤及工业含铬(VI)废水的处理开辟了一个极具潜力的新领域。微生物能不断地生长繁殖，具有很强的适应环境能力，且用微生物处理铬污染具有投资成本低、能耗小、无二次污染等特点。目前很多能够修复Cr(VI)污染的微生物被分离得到。包括Pseudomonasmandelii[4]、Bacilluspumilus[5]、Cellulosimicrobiumcellilans[6]、Sulfatereducingbacteria[7]、Desulfovibriodesulfuricans[8]、Morganellamorganii[9]等。微生物将Cr(VI)还原为Cr(III)，其修复方式主要是NADH作为还原剂的细菌酶系统，将Cr(VI)转化为可溶性NAD+-Cr(III)络合物[10]。然而，Cr(VI)对微生物有毒害作用，很多微生物在高浓度的Cr(VI)环境中无法有效还原铬或生长，因此，从环境中分离或通过基因工程手段获取高性能Cr(VI)还原菌株仍是重金属生物修复领域的重要课题。本研究以获得有效Cr(VI)还原菌株为目标，从求索溪底泥中，分离到一株Cr(VI)还原菌，并对该菌的底物利用特征、最适还原条件及Cr(VI)还原能力进行研究。

1 材料和方法

1.1 Ylb10菌的分离和培养基

YEM001(富集于三峡大学求索溪底泥)是一组有效还原Cr(VI)的菌群，由多种细菌组成，其中包括Cr(VI)还原细菌和非Cr(VI)还原细菌。以YEM001为菌源，利用梯度稀释涂布平板法分离Cr(VI)还原菌株，并经纯化分离，最终获得具有Cr(VI)能力的纯培养菌株Ylb10。分离和培养所用培养基为PCS-Cr培养基，主要成分：蛋白胨5 g/L，酵母浸粉1 g/L，氯化钠5 g/L, pH 8.5～9.0，K2Cr2O7100 mg/L。菌株培养于28 ℃生化培养箱。固体培养基则加入质量分数为1.5%的琼脂粉(索莱宝，北京)。

1.2 方法

1.2.1 Cr(Ⅵ)的测定

采用二苯碳酰二肼分光光度法[11]。

1.2.2 Cr(Ⅵ)还原率计算

Cr(VI)还原率公式：R=(1-Cf/Ci)×100%

式中：R为Cr(VI)的还原率，%；Ci为Cr(VI)初始浓度，mg/L；Cf为处理一定时间后Cr(VI)的实测浓度，mg/L。

1.2.3 Ylb10菌的16S rDNA测序鉴定及系统发育分析

将Ylb10菌培养48 h左右，收集3OD菌体量，使用TaKaRaMiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(宝生物，大连)提取细菌总DNA，所获DNA进行16S rDNA PCR。引物：27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。50 μL的反应体系：PremixTaq25 μL，27F 2 μL，1492R 2 μL，DNA 10 μL，无菌水11 μL。PCR条件：95 ℃ 预变性10 min，1个循环；94 ℃ 变性30 s, 55 ℃ 退火30 s, 72 ℃ 延伸1 min, 30个循环；72 ℃ 再延伸5 min，1个循环。

PCR产物使用Fast Pure Gel DNA Extraction Mini kit DC301 03/04(诺唯赞，南京)进行产物回收。回收后的产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将细菌的16S rDNA测序结果与NCBI数据库中已有的16S rDNA序列进行比对，并利用MEGA X进行系统发育树分析。

1.2.4 Ylb10菌生长曲线的测定

将Ylb10菌接入无铬的PCS培养基中，pH 8.0，定时检测菌体OD600，并设置无菌的空白。

1.2.5 Ylb10菌底物利用分析

利用Biolog的GEN Ⅲ鉴定板，分析Ylb10菌利用的底物。用TSA培养基，活化Ylb10菌，使用Inoculatorz棉签在琼脂平板中有细胞生长的地方沾取直径3 mm的菌落，加入IF-A接种液中，使细胞浓度为90%～98%T。将菌悬液按每孔100 μL的量加入GEN Ⅲ鉴定板的所有孔中并盖好，将接种Ylb10菌的GEN Ⅲ鉴定板置于33 ℃培养箱孵育，定时检测GEN Ⅲ鉴定板中底物变化情况。

1.2.6 Ylb10菌Cr(Ⅵ)还原性质实验

(1)氧气对Ylb10还原Cr(VI)的影响。将在固体培养基上的Ylb10菌，挑至液体PCS培养基[含100 mg/L的Cr(VI)]，置于28 ℃培养箱静置培养3 d， 8 000 r/min离心5 min，收集菌体，接种于新鲜PCS-Cr培养基，Cr(VI)浓度为100 mg/L，分别在摇床(200 r/min)和静置条件下培养，温度均为28 ℃，每组设置3个重复，定时检测OD600以及Cr(VI)含量变化。

(2)不同起始pH值对Ylb10还原Cr(VI)的影响。将Ylb10菌分别接种于pH 5、6、7、8和9共5个pH值梯度的PCS-Cr[100 mg/L Cr(VI)]培养基中，定时检测样品中的pH值，Cr(VI)浓度及OD600。

(3)不同Cr(Ⅵ)浓度对Ylb10还原Cr(VI)的影响。将Ylb10菌分别接种于含有0、50、100、200和300 mg/L K2Cr2O7的PCS培养液中，其起始培养OD600为0.2，定时检测样品中的Cr(VI)浓度及OD600。

2 结果与讨论

2.1 Ylb10菌的分离和鉴定

Ylb10菌株分离于Cr(VI)还原菌群YEM001，再连续在含Cr(VI)的定向富集下，获得较好的Cr(VI)还原能力。分离的Ylb10菌能够生长于含Cr(VI)的PCS培养基。菌落透明，圆形，偏小见图1(a)，革兰氏阴性菌见图1(b)。

图1 Ylb10菌在含铬的PCS培养基上的生长形态(a)和Ylb10菌的革兰氏染色(b)

Ylb10菌株的16S rDNA基因被测序(上海生工)，所获的序列提交到NCBI网站(GenBank MT678829)，用BLAST数据库进行序列比对，并构建系统树(图2)。结果显示，Ylb10菌与Alicycliphilusdenitrificans的16S rDNA相似率为98.07%。Alicycliphilus菌株能够降解某些污染物，如丙酮、环己醇和N-甲基吡咯烷酮，苯，甲苯和蒽，以及聚氨酯清漆和泡沫，它们还可以将Cr(VI)转化至Cr(III)[12]。

图2 基于Ylb10菌16S rDNA测序的系统发育树

2.2 Ylb10菌株利用底物的分析

33 ℃孵育24 h后，测定GEN III 鉴定板底物的利用情况(表1)。Ylb10主要利用的底物有丙酮酸甲酯、α-羟基-丁酸、L-乳酸、α-酮-丁酸、丙酸、乙酸、β-羟基-D,L丁酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸等，而对葡萄糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、糊精和甘露糖等多种糖都未表现出代谢能力。AlicycliphilusdenitrifificansK601T可以利用一元羧酸(C2-C7)、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、乳酸、丙酮酸和富马酸等[13]。小分子有机酸对Cr(VI)还原有一定影响，如在还原态绿脱石-有机酸-六价铬共存的体系中，酒石酸和苹果酸等会促进绿脱石中结构亚铁还原Cr(VI)，含有α-羟基/羰基的有机酸，可提供电子来还原Cr(VI)[14]。Ylb10对Cr(VI)的还原能力，可能与有机酸的利用有关。

表1 菌株 Ylb10 Gen III 鉴定板反应结果

2.3 Ylb10菌的生长特性

Ylb10菌在无铬的PCS培养基中的生长趋势见图3。当以0.15 OD600接种于新鲜PCS培养液中，菌株在很短时间内开始复苏生长，并在40 h内结束指数生长期，进入生长的稳定期，87 h进入衰亡期。表明该菌具有较快生长能力，这对处理环境污染物是有利的。

图3 Ylb10菌无铬条件下生长曲线

2.4 Ylb10菌还原Cr(Ⅵ)的能力

2.4.1 氧气对Ylb10还原Cr(VI)的影响

比较Ylb10在不同氧含量条件下生物量(OD600)和还原Cr(VI)的效率(图4)。结果显示：Ylb10在摇床条件下的生物量显著高于静置培养，充足的氧气更有利Ylb10的生长，见图4(a)。与生物量趋势相反，Ylb10在摇床条件下，Cr(VI)还原能力非常弱，72 h将100 mg/L 的Cr(VI)还原18.24%，而静置培养36 h还原98.70%，见图4(b)。可见，氧气对Ylb10还原Cr(VI)具有抑制作用。Cr(VI)还原可以分为酶还原和非酶还原，酶还原发生在厌氧或好氧条件下，Ylb10菌在厌氧条件下还原Cr(VI)，这可能与铬酸盐作为电子受体的膜还原酶有关[15]，而厌氧条件还原Cr(VI)，在实际应用Cr(VI)污染的水和土壤时，也更有优势。

图4 Ylb10菌在静置与摇床培养条件下对六价铬还原对比

2.4.2 不同起始pH值对Ylb10还原Cr(VI)的影响

pH对Ylb10生长和还原Cr(VI)的能力具有明显影响。Ylb10最适生长的pH值为7。而当pH值低于6，菌株的生长严重受到抑制，见图5(a)。在培养过程中，菌株的生长影响培养液的pH值，最终pH值趋向于8～9，见图5(b)。表明培养液具有代谢酸的能力，这与GEN III鉴定板检测结果相对应。

环境的pH值也影响Ylb10对Cr(VI)的还原效率。当培养液pH值为5、6时，Ylb10未表现出Cr(VI)的还原能力；当pH值为7、8、9时均表现出还原Cr(VI)的能力；且当pH值为8和9时，Ylb10还原Cr(VI)的效率最高，36 h还原Cr(VI)的效率分别为98.47%和95.54%，而当pH值为7时，48 h能还原94.78%[图5(c)]。由此可见，Ylb10菌株六价铬还原最适的pH值范围为8～9。弱碱性条件下，更有利于Ylb10菌还原Cr(VI)，结果与报道的基本一致[16-17]。嗜碱菌体内pH值在7～9时，细胞膜上的Na+/H+反向运输系统，可以将细胞质的pH值维持在一定生理范围内[18]。

图5 不同pH值条件下Ylb10菌OD600，六价铬含量和pH变化

2.4.3 不同Cr(VI)浓度对Ylb10还原Cr(VI)的影响

Ylb10还原Cr(VI)能力结果见图6。当培养液中Cr(VI)的浓度为50 mg/L时，18 h Cr(VI)可以还原96.45%；Cr(VI)的浓度为100 mg/L时，24 h可以还原93.83%；200 mg/L时，60 h可以还原99.06%；300 mg/L时，96 h可以还原2.15%。全部还原所需要的时间随着Cr(VI)浓度的升高而延长。当培养液中Cr(VI)浓度达到300 mg/L时，该菌株无法还原Cr(VI)。李维宏等[19]分离出的一株Enterobacterhormaechei菌株，可以将200、400和800 mg/L的Cr(VI)分别还原85.6%、82.1%和58.2%。何元等[20]分离的Serratiasp.S2还原能力达到20 mg/L。Sanjay等[21]分离得到的KlebsiellapneumoniaeMS 1.5和MangrovibacteryixingensisMS 2.4能够还原80 mg/L和100 mg/L的Cr(VI)。Banerjee等[22]分离的Pseudomonasbrenneri菌株在Cr(VI)浓度为60 mg/L时得到最大修复。Sarankumar等[23]分离出的BacilluscohniiSR2和BacilluslicheniformisSR3能25 h将550 mg/L的Cr(VI)分别还原82%和90%。可见Ylb10菌与其他铬还原菌株相比，较短时间具有较高的Cr(VI)还原能力。

图6 不同六价铬起始浓度Ylb10菌还原影响Figure 6 Effects of different hexavalent chromium initial concentrations on Ylb10 reduction ability

3 结论

(1)从YEM001菌群中成功分离得到一株Cr(VI)还原菌株Ylb10，经鉴定为脱氮嗜脂环物菌(Alicycliphilusdenitrificans)，革兰氏阴性菌。(2)Ylb10对氨基酸和有机酸有很好的利用。主要利用的底物有丙酮酸甲酯、α-羟基-丁酸、L-乳酸、β-羟基-D,L丁酸、丙酸、乙酸、α-酮-丁酸、L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸等，而对葡萄糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、糊精和麦芽糖等多种糖都未表现出代谢能力。(3)Ylb10静置培养条件更有利于Cr(VI)的还原。摇床(好氧)条件Ylb10菌生物量生长迅速，但是难以还原Cr(VI)，72 h 100 mg/L的Cr(VI)仅还原18.24%。静置培养条件下，36 h能将100 mg/L的Cr(VI)还原98.70%。(4)Ylb10对Cr(VI)有很高的还原能力。Ylb10菌最适生长pH值为7，最佳还原Cr(VI)的pH值为8～9。在Cr(VI)的浓度为50 mg/L时，18 h Cr(VI)可以还原96.45%；Cr(VI)的浓度为100 mg/L时，24 h可以还原93.83%；200 mg/L时，60 h可以还原99.06%。

结果表明，Ylb10菌具有较高Cr(VI)还原能力，有望应用于铬污染的水样及土壤。