Nrf2在唾液腺多形性腺瘤及癌在多形性腺瘤中的表达及意义

刘洪伟 魏丽 林凡忠 吴德报

中图分类号:R739.8 文献标志码：A doi:10.3969/j.issn.1001-3733.2021.06.022

唾液腺多形性腺瘤(salivary gland pleomorphic adenoma,SPA)是较为常见的一种唾液腺肿瘤，其发病机制尚不十分清楚，生长缓慢且后期部分容易恶变。恶变的SPA又称为癌在多形性腺瘤(carcinoma in pleomorphic adeoma,CPA)[1]。SPA和CPA手术切除后容易复发，目前多认为是肿瘤大小、组织类型、卫星灶、手术方式、边缘的侵袭性及手术中的肿瘤破溃等因素相关[2-3]。因此探究多形性腺瘤的发病机理、术后复发、恶变的机制，是目前治疗该疾病的重要一环。有关研究表明复发性多形性腺瘤多与肿瘤细胞的增殖活性相关，增殖活性的失控的原因目前成为焦点。核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-realted factor 2,Nrf2)在上皮性肿瘤细胞中的激活与抗氧化酶的诱导有关，能够早期影响氧化应激损伤或者氧自由基的传递，促进肿瘤细胞的恶变[4]。从氧化应激方面研究唾液腺多形性腺瘤较少，本研究通过免疫组化方法检查探索Nrf2在SPA和正常腮腺组织中的表达，探讨它在SPA相关生物学行为的意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

纳入2018 年04 月～2020 年10 月在山东省济宁市第一人民医院口腔颌面外科就诊的SPA及癌在多形性腺瘤中手术切除病理标本50 例，瘤旁组织标本50 例，其中原发性SPA 39 例，复发性SPA 5 例，CPA 6 例。包括男性37 例，女性13 例，年龄21～77 岁，平均年龄55.32 岁。病例纳入标准：(1)患者的临床病理资料完整；(2)患者及家属知情并签署同意书；(3)病理均诊断为SPA及CPA。肿瘤累及腮腺38 例，颊部2 例，上腭4 例，颌下6 例，肿瘤大小约2.0～4.0 cm，恶性肿瘤均无颈部淋巴结转移。

1.2 主要试剂及仪器

Nrf2抗体(Abcam公司，美国)；二抗检测系统(MaxVision)的HRP抗兔/鼠IgG产品、PBS缓冲液、苏木素染液、DAB显色剂(福州迈新生物技术开发有限公司)；脱水机(ASP300S)、切片机(RM2235)(Leica公司，德国)；包埋机(EC350，MICROM公司，德国)；显微镜(BX51，奥林巴斯公司,日本)；显微拍照系统(EOS600D，Canon公司，日本)。

1.3 免疫组织化学SP法染色

组织标本经过脱蜡水洗后，EDTA(pH 8.0)进行高温高压抗原修复，水洗，3%的H2O2室温孵育10 min，以阻断内源性过氧化酶，PBS冲洗3 次，3 min/次滴加一抗Nrf2(稀释：1∶150)室温孵育1 h，PBS冲洗3 次，3 min/次，滴加二抗，室温孵育15 min，PBS冲洗3 次，3 min/次，DAB染色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封固。

1.4 免疫组织化学结果判断

组织切片由病理科资深医师进行双盲法判读，分析镜下细胞染色及阳性细胞百分率。每张切片随机选取5 个高倍镜视野。根据细胞染色程度分为基本不染色为0 分，淡黄色1 分，棕黄色2 分，棕褐色3 分，褐色4 分；阳性细胞百分率：≤10%为0 分，11%～30%为1 分，31%～60%为2 分，61%～80%为3 分，>81%为4 分。染色程度和阳性百分率之和综合评分，0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中等阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)，其中(-)和(+)为低表达组，(++)和(+++)为高表达组[5]。

1.5 统计学分析

采用SPASS 17.0软件进行统计学分析，所有计数资料以[例(%)]表示，组间比较均采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 Nrf2蛋白在唾液腺SPA及CPA中的表达

实验发现Nrf2在SPA、CPA及腺旁正常组织中均有表达(图1)，Nrf2阳性表达主要位于细胞质和细胞膜，镜下为棕黄色颗粒。Nrf2在涎腺肿瘤周围正常组织阴性37 例(74.00%，37/50)，弱阳性13 例(26.00%，13/50)。Nrf2在肿瘤表达弱阳性22 例(44.00%，22/50)，强阳性28(56.00%，28/50)。经χ2检验Nrf2蛋白表达与肿瘤发生有显著统计学意义(表1)。

表1 Nrf2在SPA及CPA中的表达结果Tab 1 The expression of Nrf2 in SPA and CPA

图1 Nrf2在SPA和CPA中的表达(×200)

2.2 Nrf2蛋白表达与肿瘤病理特征的相关性

多形性腺瘤不同的病理特征表现为肿瘤包膜的完整性、肿瘤未侵犯包膜、肿瘤包膜不完整、肿瘤侵及包膜及卫星灶、癌在肿瘤中等。Nrf2在肿瘤细胞中不同的病理类型的表达：肿瘤不侵犯包膜且包膜完整(+)10 例，(++)3 例；肿瘤包膜不完整(++)6 例，(+)9 例；肿瘤侵及包膜及有卫星灶(++)13 例，(+)3 例，癌在多形性腺瘤(++)6 例。Nrf2在不同的肿瘤病理特征中，阳性表达率有所不同，显示肿瘤侵犯包膜、卫星灶及恶变呈正相关(表2)。

表2 SPA及CPA中Nrf2表达与病理特征的相关性Tab 2 Correlation between the expression of Nrf2 and the pathological features of SPA and CPA

2.3 Nrf2蛋白表达与原发性和复发性多形性腺瘤的相关性

原发性唾液腺多形性腺瘤中阳性表达率46.15%(18/39),复发性多形性腺瘤阳性表达率80%(4/5), 癌在多形性腺瘤阳性表达率100%(6/6)(表3)。

表3 Nrf2在原发性、复发性SPA及CPA的表达结果Tab 3 The expression of Nrf2 in primary, recurrent SPA and CPA

3 讨 论

多形性腺瘤是唾液腺肿瘤中最常见的疾病之一，其特点生长缓慢，易复发，加速生长易恶变，部分具有侵袭性。因此研究者们进行了许多实验和研究，积极寻找多形性腺瘤发病机制及良恶性肿瘤转化原因，为制定肿瘤治疗提供依据。近些年来，有大量文献报告Nrf2基因与肿瘤之间的关系，表明其与肺癌、甲状腺癌、肝癌、乳腺癌等的相关性[6-8], Nrf2是协同刺激分子B7家族成员，具有独特的生物学功能，对肿瘤的发生发展具有促进肿瘤和抑制肿瘤作用两面性，通过Nrf2-Keap1/ARE系统通路参与氧化应激反应，抵御外来因素诱发的氧化损害。Nrf2不仅具有维持机体氧化还原平衡抑制肿瘤的发生，还具有过度表达促进肿瘤细胞异常增殖能力，肿瘤细胞内Nrf2持续激活抑制细胞凋亡，从而促进肿瘤细胞的发生与恶化。吴智华等[9]舌鳞状细胞癌相关研究中发现Nrf2高表达说明其在发生发展及预后过程中起到重要作用。肿瘤的发生发展与氧化应激反应密切相关，有关研究[10-12]发现，活性氧是氧化应激的重要产物，NF-kB是氧化还原调节的氧化感受器，在多数肿瘤患者中检测到活性氧的升高，激活NF-kB途径同时也促进了细胞的增殖的调节失控，表现为肿瘤细胞无限增殖、自主分裂和肿瘤的形成。Nrf2是氧化应激反应过程中重要的效应分子，能够对外源性损伤因素进行Nrf2-Keap1系统活化[13-14]，抵制外来因素诱发的氧化损害、维持机体细胞内氧化还原平衡等方面发挥重要作用。

多形性腺瘤是涎腺中最常见的涎腺上皮肿瘤，具有病程长、多次复发、易恶变等特点，近些年研究者多从细胞遗传学、抑癌基因、基质蛋白等方面进行研究[15-17]，大多数学者[18-19]认为多形性腺瘤的复发和恶变同肿瘤所含上皮细胞和基质细胞数量密切相关，上皮细胞丰富则肿瘤容易恶变，而基质细胞丰富更易于复发。刘芳等[20]的研究发现NF-kB可能与多形性腺瘤的复发和恶变有关。近期有关研究[21]发现Nrf2在大鼠腮腺条纹状小叶间管细胞和周围腺胞细胞表达，而在多形性腺癌中表现出现高表达，并且同转移与Nrf2的过表达有显著的相关性[22]。本研究发现Nrf2在腺体组织及肿瘤腺多在细胞膜和细胞质表达，正常腺体组织内表达弱阳性表达占到26%，无强阳性表达。多形性腺瘤及癌在多形性腺瘤中Nrf2均出现表达，强弱不等，表达的强弱均同肿瘤的病理学特征及肿瘤细胞的类型相关。肿瘤包膜不完整、出现卫星灶、侵犯包膜及肿瘤恶变等均出现强阳性，同时发现细胞丰富型多形性腺瘤阳性率较基质丰富性多形性腺瘤高。本实验研究表明癌在多形性腺瘤Nrf2阳性表达率均高于复发性和原发性多形性腺瘤，因此可以推测Nrf2阳性表达率高的的多形性腺瘤更容易发生恶变、复发。

本研究结果发现，良恶性多形性腺瘤的发生、发展与氧化应激可能密切相关，Nrf2表达水平是非常重要的预测因子，Nrf2-Keap1系统通路可能参与了肿瘤的演变，Keap1的作用还需要进一步扩大样本进行研究，并通过基因检测明确具体机制。