可注射型富血小板纤维蛋白治疗口腔黏膜创伤性溃疡的动物研究

李维芝 郑柳红 宗娟娟

中图分类号:R781.5 文献标志码：A doi:10.3969/j.issn.1001-3733.2021.06.005

口腔黏膜疾病中有很多表现为反复发作的口腔黏膜糜烂/溃疡，如复发性口腔溃疡和糜烂型口腔扁平苔藓等。此类疾病往往病因不明，反复发作，难以根治。目前治疗此类病损的方法多是局部应用糖皮质激素[1]，但长期反复使用会带来诸多不良反应，如黏膜萎缩变硬、真菌感染、停药反跳等[2]。富血小板纤维蛋白(platelet rich fibrin，PRF)，因其在抗感染、促进组织愈合与再生方面的优势[3]，近十多年来在临床医学各专业领域得到广泛应用[4-5]。本课题尝试将可注射型富血小板纤维蛋白(i-PRF)应用于口腔溃疡病损的治疗，并与糖皮质激素局部注射的疗效相比较，以尝试探索一种新的可行的治疗方案。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及仪器

由长沙市天勤生物技术有限公司提供新西兰兔48 只，1.5～2.0 kg，雌雄各半，动物许可证号：SCXK(湘)2014-0010。饲养温度(25±2) ℃,通风良好,预饲养1 周。盐酸奥布卡因凝胶(沈阳绿洲制药股份有限公司)；曲安奈德溶液(浙江仙琚制药责任有限公司)；乙酸(西陇科学股份有限公司)；EOS7D相机(佳能公司，日本)；普通光学显微镜(Olympus公司，日本)；石蜡切片机(Leica Microsystems Nussloch Gmbh公司，德国)。

1.2 建模及分组

预饲养1 周后，目标位置碘伏消毒，涂表麻膏，将浸有15 μL 50%乙酸直径为6 mm的圆形滤纸片置于兔上前牙牙龈处1 min[6]，生理盐水冲洗1 min，24 h后可见溃疡。建模成功的48 只新西兰兔按随机数法随机分为4 组：i-PRF组、曲安奈德组(TA)、生理盐水组(NS)、空白对照组(BC)。

1.3 i-PRF制备及给药

建模24 h后,自i-PRF组兔子耳缘静脉取5 mL血液，700 r/min离心3 min，i-PRF取出备用。每组兔口内消毒，表麻下分别给药，每处病损一个位点注射0.1 mL相应试剂。曲安奈德浓度为0.1 mL∶2 mg,空白对照组不做处理。

1.4 体重、进食量、进水量记录

每天记录兔子的体重及进食量、进水量。

1.5 口腔溃疡面积大小测定

建模成功后，每天拍摄口内溃疡照片，以牙周探针矫正长度，用Image J软件计算溃疡面积大小。

1.6 取材

4 组兔子于给药后的第3、6、9、12天各处死3 只兔子，取材。

1.7 HE染色

组织块水洗后，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡浸蜡、包埋，切片，苏木精染色。显微镜下观察、评分，评分标准参照化学灼烧法建立动物溃疡模评估药物疗效的Karavana等[7]学者的病理评分标准(表1)。

表1 评分标准Tab 1 Evaluation criterion

1.8 数据统计与分析

2 结 果

2.1 建模后进食量及体重变化

各组间兔子平均每天体重增量i-PRF组>TA组>BC组>NS组。且i-PRF组及TA组相较于NS组及BC组的体重增量差异有统计学意义。说明对溃疡的不同处理方式中，i-PRF组及TA组对兔子日常生活的影响更小，恢复更快，因此体重增加较另外两组快(图1)。

图1 各组兔子建模后平均每天进食量及体重增量

2.2 溃疡面积变化结果

建模后第1天，目标区域可见表皮组织坏死，边界清晰，周围组织红肿。给药后3 d，可见病损面减小，表皮坏死面减小。给药后第6天可见病损面积明显减小，仍可见边界红肿。给药后第9天病损区域黏膜部分愈合，无红肿(图2)。

图2 溃疡变化

建模24 h后各组所形成的溃疡面积大小差异无统计学意义。由图3可知，在给药后第3、6天里均i-PRF组愈合最快，愈合效果与TA组相同。

图3 各时间段各组溃疡面积对比

2.3 HE染色结果

术后第3天,4 组均可见表皮坏死，胶原纤维水肿，可见炎性细胞，无新生血管。NS组胶原纤维松散紊乱。术后第6天，i-PRF组坏死组织脱落，成纤维细胞密集，可见明显新生毛细血管，炎症细胞较3天时减少。TA组及NS水组仍可见坏死组织，胶原纤维水肿。BC组炎症细胞较其他3组密集。术后第9天，i-PRF组上皮形成，新生血管增多。TA组及NS组胶原纤维水肿，对照组无坏死组织，炎症细胞较多。术后第12天，i-PRF组及TA组部分上皮形成完成，NS组、BC组上皮未完全愈合，TA组可见纤维玻璃样变(图4)。

图4 各组样本HE染色(×400)

图5显示：术后各组病理评分有差异，但差异没有统计学意义(P>0.05)。其中i-PRF组随时间的推移病理评分提高最快，TA组愈合速度较理想但组织预后结果不理想。

图5 各时间段各组病理评分折线图

3 讨 论

口腔黏膜病中，发病率最高的为口腔溃疡，口腔溃疡的病因与诸多因素相关，目前仍病因不明[8]，因此没有根治方法。但长期不愈的溃疡严重影响患者生活，以临床治疗为出发点，设计了本实验以探索一种安全有效的治疗溃疡病损的方式。

目前建立口腔溃疡动物模型主要有物理法、生物学法及化学法。其中物理法主要包括机械创伤法及放射法建模，分别用于创伤性溃疡的研究和放射性溃疡的研究。生物学法建模中最常用的方法为：自身免疫抗原法，这是构建口腔溃疡动物模型常用方法之一，此方法需先制备抗原佐剂，每两周皮内注射抗原佐剂一次，重复5 周可建模成功。其优点是，建模原理与RAU的发病机制相似，其缺点亦显而易见：(1)建模成功率不高；(2)自身免疫抗原法建模后溃疡发生部位不定，愈合时间各异[9]，不利于实验结果观察。因此本实验选用的建模方法是化学烧灼法，Cavalcante等[10]学者研究证实，该模型在病理特征和瘢痕形成机制上与人类创伤性溃疡相似，同样是研究口腔溃疡常用动物模型之一。其优点是：操作方法简单易行，建模成功率高，适用于大规模动物建模，可用于促溃疡愈合药物的临床研究。缺点是：(1)不能完全模拟口腔溃疡的发病机制；(2)化学药物腐蚀性较强，实验过程中药物易外溢，造成大面积溃疡。因此本实验建模过程中使用固定大小的滤纸片10 片浸透在150 μL的50%冰醋酸中，使药物不至于过多溢出，以固定药物的用量。

口腔糜烂/溃疡的治疗方法种类繁多，目前主要治疗目的为了加速创面愈合、缓解创面疼痛。其中最常用及疗效显著的方法为糖皮质激素的局部应用，曲安奈德注射液是最常用的糖皮质激素[11]。因此本实验将i-PRF与曲安奈德对溃疡的治疗效果做对比，以观察i-PRF是否有效。实验结果表明，i-PRF及曲安奈德对促进溃疡愈合的作用是相差无几的，甚至i-PRF促进溃疡愈合的病理评分优于曲安奈德。研究表明，反复注射曲安奈德可引起局部组织萎缩、变硬，局部抵抗力下降，易合并真菌细菌感染等并发症[11]，本实验也发现曲安奈德溶液易沉积于组织中，且曲安奈德组溃疡病损处的HE染色切片可观察到组织的玻璃样变，其组织病理评分较i-PRF组低。而i-PRF有优良的促进病损愈合的作用，其原因与溃疡组织的病理变化相关，组织学上，溃疡由两个主要结构组成：一个明显的溃疡边缘区域，以及溃疡底部的肉芽组织-结缔组织成分。溃疡边缘区域表达表皮生长因子受体(EGF-R)，并活跃地增殖[12]，i-PRF中含有大量的EGF并且可以持续释放2周[3]，EGF可通过诱导局部组织表达其受体从而促进口腔黏膜溃疡愈合[13]，这与唾液中高含量的EGF以促进口腔黏膜快速更替有异曲同工之妙，且i-PRF中的EGF含量远高于唾液；溃疡底部的肉芽组织-结缔组织成分是溃疡愈合过程中的重要组成部分，因为它提供结缔组织细胞，更重要的是提供修复溃疡瘢痕内微血管所必需的微血管[14]。而i-PRF重要的特点除了含有大量的VEGF以促进毛细血管新生，更是有相对稳定的纤维蛋白基质，更有利于组织愈合。本实验结果同样显示i-PRF组相较于有同样刺激的生理盐水组组织愈合更快，这与Crisci等[15]学者的研究结果相吻合，他们应用i-PRF治疗了3 例糖尿病足伴骨髓炎患者，均取得了较好的治疗效果，且观察了术后2年，无不良反应及复发现象。

总而言之，目前治疗溃疡病损主要是通过阻止炎症介质发生反应，降低自身免疫反应以阻止病损发展；另外通过促进细胞增殖、分化以促进病损愈合。而此文所研究的i-PRF中包含大量的细胞因子，既有抗炎作用，也可以促进细胞迁移，增殖，促进毛细血管新生[16-17]，因此i-PRF有促进溃疡病损愈合的基础条件。有学者将PRF以外敷的形式，用于治疗口腔溃疡[18]，结果表明PRF可促进溃疡愈合。但口腔环境湿润，凝胶置于病损处难以保持，因此本实验选择了液态形式的i-PRF黏膜下注射于病损组织内，有利于其更好的在病损处发挥作用。目前局部封闭治疗仍为重型口疮重要的治疗方式。因此本实验结果或可为临床应用提供参考，但其发挥作用的机制有待进一步研究。