巫山淫羊藿炮制过程中黄酮类成分含量变化研究

＊徐佳元 袁洪超 王翠萍 张宇航 冯自立,4* 陈旺,4

（1.陕西理工大学 生物科学与工程学院 陕西 723000 2.陕西金慧方中药科技有限公司 陕西 723000 3.陕西天谷药业有限公司 陕西 723000 4.陕西理工大学 陕西省资源生物重点实验室 陕西 723000）

巫山淫羊藿（Epimedium wushanense T.S.Ying）为淫羊藿的5个来源之一，对于人体有着滋补肾阳，强壮筋骨等作用[1]。其黄酮类成分，主要成分以朝藿定C为主，其含量与其他淫羊藿有一定差异[2-5]。淫羊藿黄酮类化合物的含量受药材品种来源和炮制工艺影响较大[6-9]。因此，本研究主要通过HPLC法测定巫山淫羊藿模拟炮制过程中黄酮类成分的含量，比较在不同温度和受热时间下的变化趋势，以期达到更多淫羊藿多糖苷向低糖苷或苷元的转化。

1.仪器与试药

YB-2500A多功能粉碎机，永康市速峰工贸有限公司；JA5003电子天平，上海衡平仪器仪表厂；101-3A电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；KQ-500DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Agilent 1260 lnfinity高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余所用试剂均为分析纯。

对照品朝藿定A、B、C和淫羊藿苷，为陕西乐博生化科技有限公司产品（产地：陕西，批号：20191010）。炮制所用淫羊藿为巫山淫羊藿，陕西金慧方中药科技有限公司产品（产地：汉中）。

2.方法与结果

(1)色谱条件

采用Agilent TC-C18色谱柱：4.6mm×250mm，5μm；流动相：乙腈：0.1%磷酸水溶液=30:70；柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL；检测波长：270nm。混合对照品、未处理样品及160℃炮制20min后色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)、未炮制淫羊藿样品(B)和160℃炮制20min淫羊藿样品(C)色谱图Fig.1 Chromatograms of mixed reference substance(A),unprocessed Epimedium sample (B) and processed epimedium sample (C) at 160℃ for 20 minutes

(2)样品筛选与制备

①样品筛选

由表1可以看出朝藿定A和B在海拔1400m处含量最高，朝藿定C在海拔1100m处含量最高，淫羊藿苷在海拔800m时含量较高但不稳定。因此选取淫羊藿苷含量较少的1400m药材进行实验。

表1 不同海拔淫羊藿黄酮含量表Tab.1 Flavonoids content of Epimedium at various altitudes

②样品制备

巫山淫羊藿叶片切制成1cm宽的条状，分别放入电热鼓风干燥箱中模拟炮制，于100℃、120℃、140℃、160℃和180℃下加热炮制，其中在100℃、120℃、140℃下炮制时，分别于1h，2h，4h，8h，12h时间点取出适量样品晾至室温，而在160℃、180℃下进行炮制时，于10min，20min，40min，80min，120min时间点取出样品晾干，晾至室温后，用多功能粉碎机将其粉碎成粉末，装入封装袋内保存，备用。

(3)溶液的制备

①混合对照品额配制。精密称取对照品朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷适量。用甲醇溶解配制为朝藿定A35.75g/mL、朝藿定B55g/mL、朝藿定C200g/mL和淫羊藿苷100.8g/mL的混合溶液。

②供试品溶液的配制。精密称取淫羊藿粉末约0.2g，于具塞锥形瓶中，加入50%的乙醇20mL，在天平上称定重量，超声处理40min，再次称定重量，算出两次重量差值，并用50%乙醇补足重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得到淫羊藿供试品储备液。平行制备3份供试品溶液，计算朝藿定A、B、C与淫羊藿苷含量的RSD值。

(4)方法学考察

①线性关系考察。将混合对照品工作液分别以1μL、2μL、6μL、10μL、14μL和18μL进样，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以进样量X(μg)为横坐标，峰面积值Y为纵坐标绘制标准曲线见表2。

表2 对照品标准曲线Tab.2 Standard curve table of reference substance

②精密度试验。精密称取混合对照品工作液10μL注入高效液相色谱仪，连续进样5次，各对照品峰面积RSD值为：朝藿定A 0.08%、朝藿定B 0.13%、朝藿定C 0.09%、淫羊藿苷0.12%，表明本试验方法精密度良好。

③稳定性试验。精密称取供试溶液分别于制备后的0h、12h、24h、36h和48h测定，计算朝藿定A、B、C和淫羊藿苷的含量RSD值：朝藿定A 0.36%、朝藿定B 1.82%、朝藿定C 1.52%、淫羊藿苷3.01%。表明所制得的供试品在48h内稳定。

④加样回收率试验。精密称取己知含量的淫羊藿样品于容量瓶中，加入相同含量的混合对照品溶液，制备供试品溶液，共3份，按同一色谱条件测定，计算朝藿定A、B、C和淫羊藿苷的平均加样回收率和含量RSD值分别为：朝藿定A 88%、3.89%，朝藿定B 97%、4.42%，朝藿定C 104%、3.31%，淫羊藿苷91%、2.43%。

(5)样品测定与数据处理

将供试样品溶液按上述色谱条件进行测定，应用SPSS 22.0进行单变量2因素方差分析。

(6)不同温度与受热时间对炮制淫羊藿过程中黄酮类成分含量的影响分析

为说明淫羊藿炮制过程中黄酮类成分含量是否受不同温度与受热时间的影响及影响大小，对黄酮类化合物含量的变化进行组内方差分析。结果见表3。

表3 不同温度与受热时间对黄酮类化合物含量影响的方差分析Tab.3 Variance analysis of the influence of different temperature and heating time on the content of flavonoids

从表5可见，炮制淫羊藿过程中温度对朝藿定A、B的含量无显著影响（P＞0.05），对朝藿定C和淫羊藿苷的含量有显著影响（P＜0.05）；受热时间对朝藿定A、B、C的含量无显著影响（P＞0.05），受热时间对淫羊藿苷有显著影响（P＜0.05）。

(7)炮制淫羊藿过程中黄酮类成分含量随受热时间变化趋势图

巫山淫羊藿叶片主要成分在100℃下加热的含量变化图如图2(A)所示，淫羊藿中朝藿定A、B、C含量整体降低，淫羊藿苷含量增加，炮制12h后朝藿定A、B、C降低幅度分别为-23.00%、-23.88%、-1.74%，淫羊藿苷上升幅度为+168.27%，在120℃下加热的含量变化图如图2(B)所示，朝藿定A、B、C随时间增加含量降低，炮制12h后朝藿定A、B、C含量降低幅度分别为-25.8%、-26.11%、-7.69%，淫羊藿苷含量增加，上升幅度为+555.77%，在140℃下加热含量变化图如图2(C)所示，朝藿定A、B、C随时间增加含量降低，在12h时分别降低至-28.64%，-35.07%，-28.57%，淫羊藿苷先增后减，淫羊藿苷在炮制1h时含量上升至+572.11%，12h时又降低至+241.35%；在160℃下加热含量变化图如图2(D)所示，在40min内，朝藿定A、B、C和淫羊藿苷含量变化明显，变化幅度明显分别为-60.56%，-52.99%，-8.96%，+330.77%，随后含量变化逐渐平稳，其中在20min时淫羊藿苷含量上升达到最大值+856.08%；在180℃下加热含量变化图如图2(E)所示，朝藿定A、B、C含量整体呈下降幅度较大，降幅分别为-84.51%，-64.55%，-70.13%，淫羊藿苷含量在1h时先增至+317.31%，12h时又降至+13.46%。

图2 在100℃(A)、120℃(B)、140℃(C)、160℃(D)、180℃(E)和不同时间模拟炮制过程中朝藿定A、B、C和淫羊藿苷含量的变化趋势图Fig.2 The content of chahuidine A,B,C and icariin during processing at 100℃(A),120℃(B),140℃(C),160℃(D),180℃(E) and different times change trend chart

综合上述结果表明巫山淫羊藿叶片在100℃、120℃、140℃、160℃和180℃模拟炮制过程含量变化规律为在相同的温度下，随着加热时间的增加，多糖苷（朝藿定A、B、C）含量减少，低糖苷（淫羊藿苷）随加热时间含量先增加后减少。推测巫山淫羊藿叶片在加热过程中存在多糖苷向低糖苷转化。

3.结论与讨论

本试验通过探究受热温度与时间对巫山淫羊藿中黄酮类成分的影响，获得淫羊藿药材的最佳炮制工艺。

经分析统计，朝藿定A、B含量随受热时间增加含量呈下降趋势，可能是由于其在巫山淫羊藿中含量较低；朝藿定C含量在100℃、120℃、140℃、160℃和180℃炮制过程中含量均呈降低趋势；不同温度下淫羊藿苷含量随着时间变化各不相同，但整体均呈增加趋势，并在160℃炮制20min时达到含量最大值，高于药典标准（0.50%）约一倍。因此，本实验结果将为在有限资源条件下充分利用巫山淫羊藿提供有价值的基础数据。