不同产地三叶青总黄酮及多糖含量的测定

＊阮明颖

（宁德职业技术学院 福建 355000）

1.引言

中药的疗效决定于其所含有效成分多少。植物的活性成分是其次生代谢的产物，同时也受初级代谢水平的影响。不同地区的气候、土壤条件等生态环境因子通过影响植物细胞的新陈代谢，从而影响其次生代谢产物的积累，不同地区的气候、土壤条件等生态环境因子作为影响中药材品质的一个主要因素，一直以来是中药材质量控制和评价研究的重点。研究表明，同一品种药材，产地不同，则所含有效成分就存在差异，甚至化学成份的种类及其含量相差较大，临床疗效亦如此。

三叶青药理作用的研究显示其总黄酮对肝癌、肺癌、胃癌和血癌细胞株具有“促凋亡作用”，多糖对急性肝损伤具有阻抗作用，然而现有报道中仅限于少数几个产区三叶青药材质量的评价，且多以总黄酮或少数几种黄酮成分为参考指标，对其多糖的测定研究较少。多项研究表明不同产地三叶青药材化学成分及药理活性差异大，浙江产区药材在解热抑制肝癌细胞增殖的活性等方面都占有明显的优势。郑军献等测定了不同产地10份三叶青样品中总黄酮的含量，结果表明不同产地药材总黄酮含量差异最大可达7倍，个别产区药材部分黄酮成分几乎检测不到。

此外，三叶青是多年生植物，其入药部位地下块根生长慢，需要3～5年才能达到商品药材的要求，茎叶部分常在根采收后被丢弃，浙江、广西民间采用三叶青全草入药，然而目前其化学与药理研究主要针对其块根提取物，目前三叶青化学与药理研究主要针对其块根提取物，对三叶青茎叶化学成分的研究报道亦鲜见。为了更加全面地了解不同产地三叶青药材块根及茎叶部分的质量差异性，收集了全国17批不同产地的三叶青药材，采用分光光度法分别测定了其块根及茎叶部分的总黄酮和多糖含量，为进一步化学和药理相关性研究以及三叶青的药材质量标准提供依据和参考。

2.实验部分

(1)主要仪器

SHIMADZU UV-2550紫外分光光度计；AB204-L电子分析天平（德国赛多利斯仪器公司）；80-2B离心机（湖南湘仪器实验室仪器开发有限公司）；ED-115型恒温干燥箱（德国Bingder公司）；Direct-Q 3UV超纯水机；Multiskan GO全波长酶标仪。

(2)材料与试剂

葡萄糖、NaOH、Al(NO3)3、NaNO2、乙醇、浓硫酸、苯酚、氯仿、正丁醇均选用分析醇，国药集团；芦丁对照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：J1430068），水为超纯水。

三叶青药材由浙江省丽水市农业科学研究院提供，信息详见表1。

表1 各产地三叶青信息表

续表

(3)溶液的制备

①标准对照液溶液的制备

准确称取芦丁对照品，加少量50%乙醇微热溶解，冷却后定容制成每毫升含芦丁0.3mg的标准品溶液。

②供试品溶液的制备

取一定质量的三叶青样品切成小块，置50℃烘箱烘至恒重，记录恒重值。粉碎后称取10g的粉末，用茶包袋装好置于索氏提取器中，加入500ml的50%乙醇提取，提取液经4000rpm离心10min，留取上清液用作黄酮含量检测。待乙醇挥干后用水提取多糖，用于多糖含量测定。

(4)总黄酮测定方法

①显色方法及测定方法的优化

总黄酮的测定选用芦丁作为标准品，对实际样品进行可行性分析，如图1所示，实际样品和标准品均在同一波长处出现响应。

图1 三叶青黄酮提取液和芦丁标准液的显色吸光度-波长曲线

总黄酮显色方法：在中性或弱碱性及亚硝酸钠中，黄酮类化合物与铝盐生产螯合物，加入氢氧化钠溶液后显红橙色，在400～800nm波长处扫描，对照品与样品紫外吸收基本一致，最大吸收波长为500nm，故选500nm为比色测定波长。具体方法参考文献[9]的测定方法，并对黄酮检测方法中显色剂5% NaNO2、10% Al(NO3)3和4% NaOH的用量进行适当优化。图2、图3和图4为优化曲线图。如图：5% NaNO2、10%Al(NO3)3和4% NaOH的最佳用量分别为300μl、300μl和4ml。

图2 5%亚硝酸钠体积-吸光度曲线

图3 10%硝酸铝体积-吸光度曲线

图4 4%氢氧化钠体积-吸光度曲线

经优化后总黄酮测定方法如下：精密吸取对照品或供试品溶液各2ml置比色管中，加入300μl 5% NaNO2静置6min后再加入300μl 10% Al(NO3)3再静置6min随后加入4ml 4% NaOH并用无水乙醇定容至10ml，摇匀后放置30min至显色稳定，即得对照品显色溶液及供试品显色溶液。分别以同样处理的空白显色体系为对照，测定500nm波长处的吸光度。

②标准曲线的制作

依据上面的优化后条件取不同体积的芦丁标准液来制作标准曲线，用分光光度计在500nm处测定其光密度值，以光密度值为纵坐标，以对照品溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线，如图5所示。建立的黄酮标准曲线方程为：y=6.91911x+0.00176（r2=0.99998）（n=3）。

图5 芦丁-吸光度标准曲线

③显色稳定性试验

精密量取芦丁对照品和供试溶液各2.0ml，按“2.4.1”项方法操作，在0min，15min，30min，45min，60min，75min测定吸光度，结果表明，不论是对照品还是样品显色产物在室温下吸光度值均稳定，RSD为0.17%，说明此方法在75min内稳定。

④精密度试验

精密量取芦丁对照品和供试溶液各2.0ml，按“2.4.1”项方法，反复操作6次，RSD为0.27%，结果表明仪器精密度良好。

⑤重复性试验

精密量取芦丁对照品和供试溶液各2.0ml，按“2.4.1”项方法，反复操作6次，RSD为0.64%，结果表明方法重复性良好。

⑥回收率试验

取1.0g的三叶青叶进行黄酮提取，提取液定容至250ml，测得黄酮含量为17.6mg/g。分别加入不同浓度的标准液进行加标回收测定，测定结果如表一所示。加标回收率均高达99.45%，这说明此实验的检测方法具有很好的可靠性（表2）。

表2 三叶青叶黄酮加标回收率

(5)多糖含量测定方法

①三叶青多糖提取液脱蛋白

由于蛋白质的存在对多糖的检测存在较大的干扰，因此为了得到可靠的多糖数据有必要对多糖提取液进行脱蛋白处理。用脱蛋白试剂Sevage脱蛋白试剂（氯仿:正丁醇=4:1）。脱蛋白完全标准为280nm处吸光度达到平衡。如图6所示，在多糖提取液与Sevage脱蛋白试剂体积比为4:1条件下脱蛋白在30min左右即可完成。因此在之后的脱蛋白时间选择为30min。

图6 三叶青不同部位多糖提取液脱蛋白吸光度-时间曲线

②显色方法及测定方法的优化

多糖的测定选用葡萄糖作为标准品，对实际样品进行可行性分析，如图7所示，实际样品和标准品均在同一波长处出现响应。

图7 三叶青多糖提取液和葡萄糖标准液的显色吸光度-波长曲线

多糖显色方法：硫酸的作用下，多糖水解成单糖，而后迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚生成橙黄色化合物，在波长489nm处一定浓度范围内其吸光度与浓度有线性关系，489nm为比色测定波长。并对检测方法中苯酚、浓硫酸的用量进行优化。图8和图9为优化曲线图。如图可知5%苯酚和浓硫酸的最佳用量分别为3ml和8ml。

图8 5%苯酚体积-吸光度曲线

图9 浓硫酸体积-吸光度曲线

经优化后多糖测定方法如下：取1ml的多糖提取液于比色管中，加入3ml 5%苯酚和8ml浓硫酸并剧烈震荡，震荡后于沸水浴中反应1h。取出冷却，30min后检测489nm处吸光度。分别以空白显色体系为对照。

③标准曲线的制作

依据上面的优化后条件取不同体积的葡萄糖标准液来制作标准曲线，用分光光度计在489nm处测定其光密度值。以光密度值为纵坐标，以对照品溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线，绘制标准曲线，如图10所示。建立的多糖标准曲线方程为：y=47.0249x+0.01192（r2=0.99967）（n=3）。

图10 葡萄糖-吸光度标准曲线

④显色稳定性试验

精密量取葡萄糖对照品和供试溶液各1.0ml，按“2.5.2”项方法操作，在0min，15min，30min，45min，60min，75min测定吸光度，结果表明，对照品和样品显色产物在室温下吸光度值稳定，RSD为0.28%，说明此方法在75min内稳定。

⑤精密度试验

精密量取葡萄糖对照品和供试溶液各1.0ml，按“2.5.2”项方法，重复操作6次，RSD为0.29%，结果表明仪器精密度良好。

⑥重复性试验

精密量取葡萄糖对照品和供试溶液各1.0ml，按“2.5.2”项方法，重复操作6次，RSD为0.34%，结果表明方法重复性良好。

⑦回收率试验

取1.0g的三叶青叶进行多糖提取，提取液定容至250ml，测得多糖含量为45.2mg/g。分别加入不同浓度的标准液进行加标回收测定，测定结果如表一所示。加标回收率均高达99.4%，这说明此实验的检测方法具有较好的可靠性（表3）。

表3 三叶青叶多糖加标回收率

(6)统计学分析

采用SPSS17.0统计软件分析，实验数据用X±SD表示，多个组间均值比较选用one-way ANOVA分析以及LSD两两比较。其中，P＜0.05具有统计学意义。

3.结果

(1)不同产地三叶青茎叶及块根中总黄酮含量

不同产地三叶青茎叶及块根中总黄酮含量的测定结果见表4。结果表明，17批三叶青样品总黄酮含量在3.9±0.5mg/g～46.9±3.8mg/g之间，平均含量为23.3mg/g；其中三叶青茎叶总黄酮平均含量为23.7mg/g，块根总黄酮平均含量为22.8mg/g。总黄酮含量在不同产地、相同产地不同部分的样品间均存在显著的差异（P＜0.05）。

表4 各产地三叶青茎叶及块根中总黄酮、多糖含量测定结果(X±SD，n=3)

续表

不同产区茎叶部分总黄酮含量，以浙江丽水（8号）产区的最高为46.9±3.8mg/g，高出平均含量的101.5%；以云南呈贡（2号）产区的含量最低为3.9±0.5mg/g，低于平均含量的83.2%。总的来说，浙江产区7个产地样品的总黄酮含量普遍高于其它产区，平均值为34.5mg/g，与其它产区差异达显著水平（P＜0.05）。而湖北、贵州、云南和重庆4个西南产区样品的总黄酮含量则普遍低于其它产区，平均值为7.1mg/g，与其它产区差异达显著水平（P＜0.05）。

不同产区块根部分总黄酮含量，以广西田林（17号）产区的最高为40.1±3.9mg/g，高出平均含量的72.3%；以云南呈贡（2号）产区的含量最低为7.9±0.9mg/g，低于平均含量的66.1%。总的来说，广西和江西产区4个产地样品的总黄酮含量普遍高于其它产区，平均值为37.2mg/g，与其它产区差异达显著水平（P＜0.05）。而湖北、贵州、云南和重庆4个西南产区样品的总黄酮含量则普遍低于其它产区，平均值为9.9mg/g，与其它产区差异达显著水平（P＜0.05）。

(2)不同产地三叶青茎叶及块根中多糖含量

不同产地三叶青茎叶及块根中多糖含量的测定结果见表4。结果表明，17批三叶青样品多糖含量在16.7±2.1mg/g-63.2±5.8mg/g之间，平均含量为39.9mg/g；其中三叶青茎叶多糖平均含量为33.9mg/g，块根多糖平均含量为45.9mg/g。多糖含量在不同产地、相同产地不同部分的样品间均存在显著的差异（P＜0.05）。

不同产区茎叶部分多糖含量，以浙江庆元（12号）产区的最高为49.5±5.1mg/g，高出平均含量的24.1%；以云南呈贡（2号）产区的含量最低为16.7±2.1mg/g，低于平均含量的58.1%。总的来说，浙江、福建和江西产区样品的多糖含量普遍高于其它产区，平均值为43.6mg/g，与其它产区差异达显著水平（P＜0.05）。而湖北、贵州、云南和重庆等产区样品的多糖含量则普遍低于其它产区，平均值为20.3mg/g，与其它产区差异达显著水平（P＜0.05）。

不同产区块根部分多糖含量，以浙江丽水（8号）产区的最高为63.2±5.8mg/g，高出平均含量的58.4%；以广西乐业（13号）产区的含量最低为25.6±3.1mg/g，低于平均含量的35.8%。总的来说，浙江、福建和江西产区样品的多糖含量普遍高于其它产区，平均值为57.6mg/g，与其它产区差异达显著水平（P＜0.0）。而湖北、贵州、云南和重庆等产区样品的多糖含量则普遍低于其它产区，平均值为29.2mg/g，与其它产区差异达显著水平（P＜0.05）。

4.讨论

药用植物的品质受到其生长过程中各内外因素的影响。“离其本土，则质同而效异”充分反应了产地与质量之间的关系。由于地理分布不同，各地区的土壤、气温、水质、雨量等生态因子差别很大，使得药用植物特定的基因型在不同的生态环境下受到复杂的调控，从而导致次生代谢调控关键酶基因的时空差异表达。另一方面，土壤中一些明显参与其生物活性成分合成的微量元素等物质，也能显著影响药用植物药效成分的质与量。

三叶青黄酮及多糖为其药理活性物质，然而多项研究表明药材市场上三叶青种质混杂，化学成分及药理活性差异大，例如：郑军献等采用分光光度法测定了浙江和广西产地10份三叶青样品中总黄酮的含量，结果显示不同产地药材黄酮含量差异最大可达7倍。许文等采用UPLC-MS/MS定量分析测定30批不同产地三叶青中10种黄酮类成分结果表明，各类成分含量差异悬殊，甚至有些批次中未检测出。本次研究结果显示，浙江丽水产区与云南呈贡产区的三叶青总黄酮含量差异超过10倍。浙江庆元产区与云南呈贡产区的三叶青多糖含量差异超过3倍。综合总黄酮及多糖含量2项指标来看，浙江、福建和江西产区三叶青药材品质较好，而湖北、贵州、云南和重庆等产区药材品质较低。各地三叶青生长地域界限分明，生长习性和药材品质有较大差异。三叶青入药部位多为地下块根，浙江、广西民间有部分地区采用三叶青全草入药，然而目前三叶青茎叶化学与药理研究报道较为罕见。本研究还显示黄酮及多糖在茎叶部分含量也较高，其中浙江产区三叶青样品茎叶部分总黄酮含量甚至显著高于块根部分，具有潜在的开发利用价值，尚有待其药理学活性的深入研究以进一步明确三叶青茎叶的药用价值，为扩大其资源利用提供科学依据和指导。

三叶青具有多种药效功能，然而目前其药材质量控制的指标性成分尚未明确，仅以总黄酮或少数几种黄酮成分作为三叶青药理作用研究和药材质量评价为参考指标是不全面的，有待进一步深入研究其化学成分和药理作用，以更全面的规范三叶青药材模式识别方法和质量评价体系。