雨生红球藻中代谢物及矿质元素对高光的响应

王晓丹，刘宝玲，李润植

（山西农业大学农学院，山西太谷030801）

藻类植物生活在复杂多变的栖息地，经常要适应极其恶劣的环境。它们的代谢受到水温、盐分、光照和营养成分等因素的影响，为了生存，被迫快速适应不断变化的环境条件，产生大量具有生物活性的次生代谢物[1]。在逆境条件下，雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）能大量积累虾青素及一些化合物，其中，虾青素具有抗氧化、抗炎、抗癌和增强免疫等活性，被广泛应用于功能型营养食品和药物中。因此，研究逆境条件下，雨生红球藻中这些活性物质合成积累机制以及建立相应的调控技术，促进微藻高效生产这些有益生物资源，以达到商业化应用是目前研究的一个活跃领域[2]。

应对不利的环境条件，植物（微藻）会在细胞和分子水平上利用各种机制来应对[3]。前期的研究表明，雨生红球藻797在高光胁迫条件下，细胞内产生虾青素，同时发生细胞自噬对抗活性氧（reactive oxide species，ROS），总脂肪酸的含量增加，脂肪酸成分发生改变，饱和脂肪酸增加而不饱和脂肪酸降低[4]。雨生红球藻中氨基酸和无机矿质元素是否也协同虾青素参与逆境调控却未知。前人研究表明，脯氨酸在花生[5]、栅藻（Scenedesmus quadricauda）[6]和嗜盐真菌（halophile fungi）[7]中，具有抗逆活性。笔者研究17种水解氨基酸，以探讨高光诱导雨生红球藻中虾青素积累时，脯氨酸是否也参与对抗高光的氧化胁迫，以及其他氨基酸的代谢变化。一些藻类能吸收周围水域中的可吸收元素，一些元素在藻细胞内的积累量能达到其生活水域中该元素浓度的数倍[8]。所以，在研究雨生红球藻适应环境胁迫下，有机化合物（虾青素）积累变化的同时，也需要分析细胞体内氨基酸和无机元素的动态变化。

本试验对雨生红球藻797藻株在高光胁迫条件下，藻细胞形态、细胞中虾青素含量、氨基酸和无机元素等动态变化进行分析，以期深入揭示雨生红球藻细胞胁迫应激的生理生化反应机制。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 藻种及培养基 雨生红球藻（797株系）购自上海光语生物科技有限公司。藻细胞以光自养的方式培养在无菌的BG-11培养基中[9]。

1.1.2 主要仪器 氨基酸自动分析仪（Biochrom 30+）；正置显微镜（奥林帕斯，BX53，日本）；原子吸收光谱仪（德国耶拿Zip 700型）；SP-Max 2300A2光吸收型全波长酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司）；血球计数板，上海求精生化试剂仪器有限公司；人工气候箱（宁波东南仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 雨生红球藻797的培养 在人工气候箱中静置培养，正常条件及高光诱导条件下的培养参照文献[4]进行。

1.2.2 雨生红球藻797生长曲线的测定 在紫外消杀4 h以上的超净工作台中，进行雨生红球藻的接种。无菌条件下，吸取10 mL雨生红球藻藻液加入到灭菌的250 mL锥形瓶中（含100 mL BG-11液体培养基），在人工气候箱中静置培养。每间隔2 d进行一次取样，使用血细胞计在正置显微镜下进行细胞计数[9]。同时，利用酶标仪在680 nm波长下测定藻液的吸光度值（OD680）。试验设置3个平行，每个平行测定3次。

1.2.3 细胞形态的显微观察 在高光胁迫条件下处理雨生红球藻，在0、7、10、13、16和19 d取各试验组的悬浮藻液1 mL，放入1.5 mL离心管中，放置1 min左右，藻体沉降到离心管底。吸取10 μL沉降的藻液滴到载玻片上，盖上盖玻片，在正置显微镜下观察细胞形态并拍照采集图片。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 虾青素的测定 分别取高光胁迫7、10、13、16和19 d的藻细胞冻干样品各5 mg左右，使用二甲基亚砜提取[4]后，采用分光光度法测定虾青素的质量浓度[10]。

式中，CA为虾青素的质量浓度，OD530为530 nm处的吸光度值，m（mg）为冻干细胞样品的质量。

1.3.2 氨基酸的测定 称取0.05 g左右的雨生红球藻冻干藻粉，采用酸水解法测定17种氨基酸[11]。

1.3.3 粗蛋白的测定 称取100 mg左右的冻干藻粉，使用南京建成生物公司的试剂盒进行测定。按照试剂盒的说明进行总蛋白的测定，使用酶标仪测定样品、双蒸水和蛋白标准品的OD595值。

1.3.4 矿质元素的测定

1.3.4.1 样品的消解 按照国标GB/T5009.12—2003、GB/T5009.15—2003和GB/T5009.17—2003中的方法进行消煮，待消煮液冷却后转移入10 mL容量瓶，加入1%（m/V）SrCl21 mL，再用1%（V/V）的HCl定容到10 mL。同时，做2个试剂空白。

1.3.4.2 标准溶液的配制 在10 mL的容量瓶中加入1 mL 1%的SrCl2和各浓度梯度对应的标准溶液量，再用1%的HCl定容到刻度。标准溶液购买自钢铁研究总院分析测试研究所钢研纳克检测技术有限公司，属于国家标准物质。使用原子吸收光谱仪的火焰法进行测定。各元素标准曲线的相关系数（r）≥0.98。

1.4 数据分析

所有数据采用SPSS 20统计软件进行统计分析。采用t检验来分析培养细胞处理组（诱导16 d）和对照组（指数生长中期）差异是否有统计学意义，以*和**分别表示P≤0.05和P≤0.01[12]。

2 结果与分析

2.1 正常培养条件下，雨生红球藻797生长密度的动态变化

为了建立雨生红球藻绿色生长阶段的生长曲线以及OD680值和单位体积细胞个数的对应关系，在正常培养条件下，每2 d取样测定OD680值和进行细胞计数。从图1-A可以看出，雨生红球藻797在OD680＝0.6左右时进入指数生长中期，当OD680达到0.759时，开始进入稳定期。在人工气候箱中，用盛有100 mL BG-11培养基的250 mL锥形瓶培养该藻株，细胞密度最大可达4.167×105个细胞/mL。需要指出的是，一般来讲，以分裂方式进行繁殖的微藻等微生物，接种到适应的液体培养基中，生长曲线会出现4个阶段：缓慢生长期、对数增长期、稳定期和凋亡期。本试验是以1∶10的比例进行藻液接种，因此，没有出现缓慢生长期（图1-B）。此外，本试验测定雨生红球藻绿色阶段的生长情况，所以，也没有检测凋亡期。

利用作图分析软件origin 9.1，以测定生长曲线的雨生红球藻藻液的OD680值为横坐标，细胞密度为纵坐标，先建立OD680值和细胞密度对应的散点图，再进行线性拟合。由图2可知，在标准培养条件下，绿色生长阶段的雨生红球藻797的OD680和细胞密度呈线性关系。OD680在0.1～0.9的范围内，符合朗伯-比尔定律，获得的回归方程为y＝-0.769 98＋5.891 81x，式中，y是细胞密度，即细胞个数，单位：105个细胞/mL，x是OD680测定的吸光度值，相关系数为r＝0.987 64。说明2个变量线性相关性显著。

2.2 高光诱导对雨生红球藻细胞形态和虾青素含量的影响

从图3、4可以看出，指数生长期（0 d）的雨生红球藻797呈现绿色的球形或椭圆形；在高光诱导7 d时，雨生红球藻797细胞都变成圆形，整体呈红色，开始积累虾青素，含量达0.59%；在高光诱导10 d时，雨生红球藻797虾青素基本充满整个细胞，还能看到一点黄绿色在细胞周围，虾青素含量达到1.27%；在高光诱导13、16 d时，细胞中充满虾青素，雨生红球藻797细胞呈现黑红色，虾青素含量分别达到2.17%和2.78%；高光诱导19 d时，虾青素含量高达3.18%，整个细胞的边缘变成亮红色，细胞中夹杂黑红色。表明随着雨生红球藻细胞内虾青素含量的增加，细胞形态、大小和颜色也发生改变。

2.4 高光胁迫下雨生红球藻氨基酸含量和粗蛋白含量的动态变化

从表1可以看出，在高光诱导条件下，雨生红球藻797细胞中的脯氨酸含量极大增加，由指数生长中期（对照）的12.61 μg/mg增加到高光诱导16 d时的24.72 μg/mg，差异极显著，增加了96.03%（P≤0.01）；而在高光诱导16 d时，与对照相比，其他氨基酸成分都明显降低（P≤0.01）。其中，异亮氨酸＋亮氨酸和苯丙氨酸的含量分别降低了78.28%和77.75%；缬氨酸＋胱氨酸降低了39.13%；谷氨酸、蛋氨酸、组氨酸和精氨酸含量分别降低了58.40%、57.07%、59.19%和50.64%；其他氨基酸含量都下降了68.52%～73.47%。在高光诱导条件下，与大部分氨基酸含量都显著下降相对应，粗蛋白的含量也显著降低，由对照的244.21 μg/mg降低到高光诱导16 d时的196.43 μg/mg，减少了19.57%（P≤0.01）。

表1 雨生红球藻797在指数生长中期（对照）和虾青素高积累期（诱导16 d）的氨基酸和粗蛋白含量 μg/mg

2.5 高光胁迫下雨生红球藻797主要矿质元素含量的动态变化

从表2可以看出，与对照组相比，高光处理16 d的雨生红球藻细胞中Ca和Mg含量都显著增加（P≤0.01），Ca在雨生红球藻细胞中的含量由0.740 μg/mg增加到1.680 μg/mg，增加了127.03%；雨生红球藻细胞中Mg的含量由0.046 μg/mg增加到2.677 μg/mg，增加了5 719.5%。K、Na、Fe、Cu、Mn和Zn的含量都显著降低（P≤0.01），分别比对照组降低了71.53%、60.64%、79.17%、54.55%、81.44%和41.33%。

表2 雨生红球藻797在指数生长中期（对照）和虾青素高积累期（诱导16 d）的矿质元素含量 μg/mg

3 结论与讨论

本研究表明，在雨生红球藻797的绿色生长阶段OD680和细胞个数之间存在强线性关系（r＝0.987 64）。在其他研究结果中也验证了绿藻的OD680和细胞个数之间存在很强的线性关系[13]。

在正常培养条件下，雨生红球藻细胞是处于营养生长阶段的能动的绿色细胞。但是，在逆境条件下，雨生红球藻细胞先是由能动的绿色细胞变为不能动的绿色细胞，随后，开始积累虾青素变为不能动的红色细胞，最后积累高量虾青素的红色孢子囊细胞形成[14]。本研究对绿色阶段（指数生长中期）以及逆境高光诱导阶段雨生红球藻细胞形态的观察与前人对雨生红球藻营养生长阶段及逆境条件下细胞形态变化的描述一致。

光是微藻的能量来源，在微藻的培养中起到重要作用。但是，持续的高光照不利于雨生红球藻绿色阶段细胞生物量的增长，因为持续的高光照使雨生红球藻细胞变成厚壁孢子而停止分裂[15]。所以，在本试验高光诱导的时间段内（0～19 d），雨生红球藻797细胞内的虾青素持续积累，以抵抗高光氧化产生的ROS对藻细胞的细胞膜、DNA和蛋白质等的损伤[16]。

本研究表明，在高光诱导条件下，雨生红球藻797细胞中脯氨酸的含量比对照组增加了96.03%。这是因为在不利的环境条件下，细胞通过改变脯氨酸代谢来保持细胞内环境的平衡[17]。前人研究表明，雨生红球藻在积累虾青素的过程中，细胞内的蛋白质含量下降了36.7%[18]，并且蛋白质的含量与氨基酸的含量成正相关。本试验中雨生红球藻797藻株在高光胁迫下细胞大部分氨基酸的组分降低，粗蛋白的含量降低了24%。

在高光胁迫下，雨生红球藻797细胞的Ca含量显著增加（P≤0.01），这是因为雨生红球藻细胞在逆境条件下形成厚壁孢子，钙离子主要以果胶酸钙的形式存在于细胞壁中，起到固定细胞壁和维持细胞形态的作用[19]。表明雨生红球藻对高光胁迫产生了适应机制，对钙的吸收增加，以利于逆境胁迫信号的传递、细胞壁的增厚和维持细胞膜形态，防止高光毒害产生的ROS等有害物质对细胞膜造成的破坏。

前人研究表明，缺Mg严重影响植物的光合作用[20]。本研究结果表明，雨生红球藻797在高光条件下，Mg含量升高，以保证胁迫条件下，光合作用的正常进行；Fe含量显著下降，可能是因为Fe2+参与催化哈伯-韦斯反应产生ROS，以促进碳源向虾青素合成途径转移来提高虾青素含量[21-22]。

本研究表明，高光胁迫下雨生红球藻细胞内K的含量极显著低于对照组（P≤0.01）。与本试验结果一致的是，对番茄的根区同时进行低温和盐胁迫的诱导，使得K的含量显著下降[23]。这可能是因为逆境胁迫影响K+转运蛋白酶的活性，进而抑制钾离子的吸收[24]。

本研究结果表明，高光胁迫使得雨生红球藻细胞中Na、Cu、Mn和Zn的含量极显著低于指数生长中期（对照）雨生红球藻中的含量（P≤0.01）。前人研究也表明，干旱胁迫显著抑制了番茄、玉米和苹果植株对大量元素和微量元素的吸收[25-27]。这是因为逆境胁迫抑制了植物和微藻对矿质元素的同化吸收，导致植株和微藻相对生长速率和生物量积累的减少[28]。

总之，高光胁迫下，雨生红球藻细胞中粗蛋白和大部分氨基酸以及矿质元素含量降低，以降低光合作用和细胞的生长率，同时，诱发虾青素积累、脯氨酸、Mg和Ca等元素含量升高，以增强藻细胞抵御氧化胁迫的活力，共同应对高光对藻细胞造成的毒害作用。本研究为探究雨生红球藻细胞抵抗逆境胁迫的相关机制等方面奠定了基础，进而为建立外源调控虾青素富集的有效技术提供了科学依据。