防己黄芪汤对小鼠抗炎镇痛作用及其机制研究

覃清霞 何欢 梁艳媚 唐巨英 戴传勇

（广西农业职业技术学院，广西 南宁530007）

防己黄芪汤出自《金匮要略》：“风湿脉浮身重，汗出恶风者，防己黄芪汤主之”，由防己、黄芪、甘草、白术组成，常加以姜、枣调和营卫，具有祛风除湿、益气固表之功效。现在防己黄芪汤加减法被运用于类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、原发性肾小球肾炎等炎性疾病的临床治疗中[1-3]。而目前对于防己黄芪汤抗炎镇痛药理作用及其作用机制研究甚少，因此本研究通过建立动物炎症及疼痛模型，观察防己黄芪汤对小鼠的抗炎镇痛作用，并初步探讨其可能机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

昆明小鼠，6～8周龄，体重18～22 g，雌雄各半，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号为NO.43004700059138。动物按性别分笼饲养于空调室内，室温（22±2）℃，湿度（60±5）%，自由摄食饮水。

1.2 主要试剂与仪器

防己、黄芪、甘草、白术均购自华泰中药饮片有限责任公司；生理盐水，贵州科伦药业有限公司，批号D19042704；阿司匹林，江苏平光制药有限责任公司，批号190301；地塞米松，浙江仙琚制药股份有限公司，批号200132；伊文思蓝，sigma公司，批号E2129；二甲苯，天津富宁精细化工有限公司，批号20200305；N-1-萘乙二胺盐酸溶液，广州检测科技有限公司，批号ZCD98；SOD试剂盒，Solarbio公司，批号BC0170；冰醋酸，重庆川东化工（集团）有限公司，批号20191001；对氨基苯磺酸，天津市大茂化学试剂厂，批号20200628；氢氧化钾，广东省化学试剂工程技术研究开发中心，批号20170214；磷酸，重庆川东化工（集团）有限公司，批号20200601；电子天平，昆山优科维特电子科技有限公司，型号LQ-C5001；分析天平，苏州培科实验室仪器科技有限公司，型号AS220-R2；电热板，北京莱伯泰科技仪器股份有限公司，型号EH-20A；离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司，型号TD5A-WS型；紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司制造，型号752N型。

2 实验方法

2.1 防己黄芪汤制备

防己黄芪汤由防己12g、黄芪15g、甘草6g、白术9g组成。取上述6剂中药，常规方法水煎煮，煎液浓缩至126mL，得2g/mL防己黄芪汤水煎剂，4℃冰箱保存备用。小鼠用药剂量按小鼠（20g）与人（70kg）服用中药量进行换算，小鼠所用剂量为6.4g/kg，后续试验均按此药量进行。

2.2 抗炎实验

2.2.1 防己黄芪汤对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响取昆明小鼠30只随机分为5组，分别为防己黄芪汤高剂量组（12.8g/kg）、中剂量组（6.4 g/kg）、低剂量组（3.2g/kg）、地塞米松组（0.025g/kg）及空白对照组。防己黄芪汤各组灌胃给药，每天一次，连续7d，空白对照组给予相应体积的生理盐水。地塞米松组于第4d开始灌胃给药，每天一次，连续4d。末次给药后1h，在小鼠右耳正反面涂抹0.05mL二甲苯致炎，左耳耳廓不涂作为对照，40min后，摘眼球取血，分离血清备用。脱颈椎处死小鼠，使用直径为8mm的打孔器在小鼠左右耳相同部位取下耳片并称重，以左右耳片重量差值表示肿胀度，并计算肿胀抑制率。

肿胀度=右耳片重量－左耳片重量

抑制率=（空白对照组耳肿胀度-给药组耳肿胀度）/空白对照组耳肿胀度×100%

2.2.2 防己黄芪汤对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 动物分组及给药同2.2.1。末次给药后1h，各组小鼠按体重0.1mL/10g的量尾静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水溶液，随即腹腔注射0.6%醋酸溶液。20min后脱颈椎处死小鼠，打开腹腔，使用4mL生理盐水分3次洗涤腹腔，将洗涤液转移至15mL离心管中并用生理盐水定容至10mL，3000r/min离心10min，取上清液，于590nm处检测吸光度A值，计算炎症抑制率。

炎症抑制率（%）=（空白对照组吸光度-给药组吸光度）/空白对照组吸光度×100%。

2.3 镇痛实验

2.3.1 防己黄芪汤对小鼠热板痛阈值的影响 将热板仪温度设定为55℃，取健康雌性小鼠放入热板中，5～30s内舔足者纳入实验。取符合标准的雌性小鼠30只，随机分为5组，分别为防己黄芪汤高剂量组（12.8g/kg）、中剂量组（6.4g/kg）、低剂量组（3.2g/kg）、阿司匹林组（0.025g/kg）及空白对照组。每组给药前重复测定痛阈值2次，取平均值作为正常痛阈值。各组灌胃给药，每天一次，连续7d，空白对照组给予等体积生理盐水。末次给药后30min、60min、120min分别测定各组小鼠痛阈值2次，取平均值作为痛阈值。如60s内无反应的小鼠，立即取出，防止烫伤，痛阈值按60s计算。

2.3.2 防己黄芪汤对醋酸致小鼠扭体的影响 取昆明小鼠30只随机平均分为5组，动物给药同2.3.1。末次给药后1h，各组小鼠按0.1mL/10g腹腔注射0.6%醋酸溶液，记录小鼠出现扭体反应的潜伏期以及15min内扭体次数，计算扭体反应镇痛率。

镇痛率=（空白对照组扭体次数-给药组扭体次数）/空白对照组扭体次数×100%

2.4 防己黄芪汤对小鼠脏器重量系数的影响

耳肿胀实验结束，处死小鼠，打开腹腔，观察各组小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器情况并称重，计算脏器重量系数。

脏器重量系数（%）=脏器重量/体重×100%

2.5 防己黄芪汤对小鼠血清中PGE2、NO、SOD含量的影响

2.5.1 紫外分光光度法检测小鼠血清中PGE2含量取0.2mL小鼠血清，加入0.5mol/L氢氧化钾甲醇溶液1mL，混合均匀，置于50℃水浴20min，取出稍冷却后2000r/min离心3min，取上清液，在278nm处测定吸光度A值，以A值表示PGE2含量。

2.5.2 Griess法检测小鼠血清中NO含量 配制10mmol/mL亚硝酸钠标准液、试剂A（取85%浓磷酸6mL、去离子水70mL及无水对氨基苯磺酸1g混合均匀，定容至100mL）、试剂B（0.1%N-1-萘乙二胺盐酸溶液）。亚硝酸钠标准液按浓度梯度进行稀释，分别加入试剂A与试剂B，在540nm处检测吸光度值。以标准浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘出标准曲线，根据样本吸光度值及直线回归方程计算样品中NO浓度。

2.5.3 硫代巴比妥酸（TBA）法检测小鼠血清中SOD活性 根据试剂盒说明书方法，测定小鼠血清中SOD活性。

2.6 统计学处理数据

以±S表示，利用SPSS20.0统计软件，组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 防己黄芪汤对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

防己黄芪汤对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响如表1所示，与空白对照组比较，地塞米松可明显降低二甲苯所致小鼠耳肿胀度（P<0.01），其肿胀抑制率为57.02%，防己黄芪汤低、中、高剂量亦可明显降低小鼠耳肿胀度（P<0.05，P<0.01），抑制率分别为26.91%、35.09%、48.84%。

表1 防己黄芪汤对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（x±S，n=6）

3.2 防己黄芪汤对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

防己黄芪汤对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响如表2所示，与空白对照组比较，地塞米松可明显降低醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的增加（P<0.01），防己黄芪汤低、中、高剂量亦可降低小鼠腹腔毛细血管通透性，并呈剂量依赖性（P<0.05，P<0.01）。

表2 防己黄芪汤对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响（x±S，n=6）

3.3 防己黄芪汤对小鼠热板痛阈值的影响

防己黄芪汤对小鼠热板痛阈值的影响如表3所示，与空白对照组比较，在末次给药后30min，防己黄芪汤高剂量可明显提高小鼠痛阈值（P<0.05），而低、中剂量及阿司匹林并无明显作用，末次给药后60min，防己黄芪汤各剂量及阿司匹林均可显著提高小鼠痛阈值（P<0.05，P<0.01），末次给药后120min，阿司匹林及防己黄芪汤中、高剂量可提高小鼠痛阈值，并具有统计学差异（P<0.05，P<0.01）。与给药前比较，阿司匹林在末次给药后60min、120min均可提高小鼠痛阈值（P<0.01），防己黄芪汤低剂量仅在给药后60min可明显提高痛阈值（P<0.01），而中剂量在给药后60min、120min可显著提高痛阈值（P<0.05，P<0.01），高剂量在末次给药后30min、60min、120min均可显著提高小鼠痛阈值（P<0.05，P<0.01）。

表3 防己黄芪汤对小鼠热板痛阈值的影响（x±S，n=6）

3.4 防己黄芪汤对醋酸致小鼠扭体的影响

防己黄芪汤对醋酸致小鼠扭体的影响如表4所示，与空白对照组比较，阿司匹林可明显延长醋酸致扭体反应潜伏期，减少扭体次数（P<0.01），镇痛率为50.49%。防己黄芪汤各剂量均可延长小鼠扭体潜伏期（P<0.05，P<0.01），中剂量与高剂量明显减少小鼠扭体次数（P<0.01），镇痛率分别为42.02%、36.82%，而低剂量有减少小鼠扭体次数的趋势，但未见统计学差异。

表4 防己黄芪汤对醋酸致小鼠扭体的影响（x±S，n=6）

3.5 防己黄芪汤对小鼠脏器重量系数的影响

防己黄芪汤对小鼠脏器重量系数的影响如表5所示，与空白对照组比较，在给药期间，0.025g/kg地塞米松、防己黄芪汤低剂量与中剂量对小鼠心、肝、脾、肺、肾脏器重量系数无明显影响，防己黄芪汤高剂量对小鼠心、肝、肺、肾脏器重量系数亦无明显影响，但明显提高小鼠脾脏器重量系数（P<0.05）。

表5 防己黄芪汤对小鼠脏器重量系数的影响（x±S，n=6）

3.6 防己黄芪汤对小鼠血清中PGE2、NO含量及SOD活性的影响

防己黄芪汤对小鼠血清中PGE2、NO含量及SOD活性的影响如表6所示，与空白对照组比较，地塞米松可显著降低血清中PGE2和NO含量、提高SOD活性（P<0.01），防己黄芪汤中、高剂量也明显降低PGE2和NO含量、提高SOD活性（P<0.05，P<0.01），而低剂量有降低PGE2和NO含量、提高SOD活性的趋势，但不具统计学意义。

表6 防己黄芪汤对小鼠血清中PGE2、NO含量及SOD活性的影响（x±S，n=6）

4 结论与讨论

防己黄芪汤出自《金匮要略》，防己祛风湿止痛，黄芪益气固表，两药合用可祛风除湿、清热止痛、利水消肿，白术补气健脾祛湿，同时又增强防己与黄芪的功效，再以姜枣调和营卫，益气祛风，健脾利水。本研究通过二甲苯致小鼠耳肿胀、醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加方法，观察防己黄芪汤抗炎效果，通过热板法及醋酸扭体法观察镇痛效果。研究发现防己黄芪汤可抑制二甲苯所致的小鼠耳肿胀，降低醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的增加，提高热板痛阈值，延长扭体反应潜伏期，减少扭体次数，提示防己黄芪汤对炎症及疼痛具有一定抑制作用。

炎症是机体对生物、化学或物理等作用产生的一种适应性反应，是多种生理病理过程的基础，炎症过程中往往伴随着疼痛，而在炎症发生发展过程中，炎症介质如PGE2、NO等起重要作用。[4-6]前列腺素是动物体内重要的脂质介质，由脂肪酸花生四烯酸经酶促代谢合成，而PGE2是各种组织中检测到最多的前列腺素，参与多种生理病理过程，如发热、疼痛及炎症等，加剧炎性疾病的发展。[7,8]NO具有针对致病性微生物的细胞毒性特性，同时也具有对宿主组织的破坏作用，是炎症反应的介质及调节因子，可介导炎症反应促进破坏，这些反应包括舒张血管、增加血管通透性等，另外NO也参与疼痛的发展过程，有研究发现局部注射NO会产生疼痛，提示NO可能激活周围痛觉感受器。[9-11]SOD是需氧生物体内的通用酶，可催化超氧化物转化为氧和过氧化氢，平衡体内自由基水平，从而限制这些自由基的潜在毒性，因此SOD的活性常被用来反映体内自由基水平。[12]本研究发现防己黄芪汤可降低炎症模型小鼠血清中的PGE2、NO含量，提高SOD活性，提示防己黄芪汤抗炎镇痛作用可能与抑制炎症介质PGE2和NO的生成、提高SOD活力有关。

综上所述，防己黄芪汤具有明显抗炎镇痛作用，作用机制可能与减少炎症介质的产生、提高机体抗氧化能力有关，更全面的机制还有待进一步探讨。