基于网络药理学研究五苓散治疗慢性肾衰竭的潜在机制

熊致立 周珊珊 巴元明

摘要 目的：基于网络药理学方法，研究五苓散治疗慢性肾衰竭的机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索五苓散活性成分，使用有机小分子生物活性（PubChem）数据库、瑞士生物信息学研究所（SIB）数据库进行靶点排查。根据GeneCards数据库得到疾病相关靶点。并利用Omicshare平台将药物及疾病靶点进行匹配。采用String Version 10.5数据库构建靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。利用Omicshare软件对关键靶点进行基因本体（GO）富集分析、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。采用CytoscapeVersion3.8.0对药物-成分-靶点-信号通路进行分析。结果：筛选得到五苓散活性成分532个，治疗靶点112个，五苓散治疗疾病的主要活性成分包括啤酒甾醇（Cerevisterol），β谷甾醇（β-sitosterol），泽泻醇（Alisol B）等;治疗疾病的核心靶点包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等;主要涉及的信号通路包括Toll-like Receptor（TLR）、T Cell Receptor（TCR）等，生物过程主要包括细胞凋亡过程、磷酸盐代谢过程等。结论：本研究以网络药理学方式探究了五苓散治疗慢性肾衰竭的多途径-多靶点的作用机制，推断五苓散主要通过调节TLR/NF-κB、T Cell Receptor等信號通路，抑制TNF-α、IL-6等相关炎症介质活性从而延缓慢性肾衰竭。为进一步的实验提供理论参考。

关键词 五苓散;网络药理学;慢性肾衰竭;靶点;作用机制

Abstract Objective：To explore the mechanism of Wuling powder in the treatment of chronic renal failure based on the network pharmacology.Methods：The main active ingredients of Wuling powder were obtained through TCMSP.SwissTargetPrediction and PubChem database were used to predict and filter the relevant action targets，and then a database of potential targets was built.Next GenCards database was used to screen reported therapeutic targets for chronic renal failure.Active components and disease targets were matched based on the Omicshare.Target protein-protein interaction（PPI） network was constructed by String Version 10.5 database.Omicshare software was used for gene ontology（GO） enrichment analysis and the Kyoto Encyclopedia of genes and genomes（KEGG） pathway enrichment analysis of the key targets.Cytoscape Version 3.8.0 software was used for visualized analysis of drugs-active ingredient-key target network and the ingredient-target-signal pathway network.Results：Totally 532 active ingredients of Wuling powder and 112 targets of anti-chronic renal failure effect were screened out.The main components of Wuling powder used to treat chronic renal failure include Cerevisterol，β-sitosterol and alisol B.Core targets including TNF-α and IL-6，and receptor signaling pathways are mainly Toll-like receptor，T cell receptor signaling pathway，etc.Biological process（BP） includes regulation of programmed cell death，phosphorylation and positive regulation of cell proliferation.Conclusion：This study explored the mechanism of Wuling powder in the treatment of chronic renal failure based on the method of network pharmacology.The mechanisms of its anti-chronic renal failure effects may be related to inhibiting TNF-α、IL-6 by regulating TLR/NF-κB、T cell receptor signaling pathway.It provides theoretical reference for further experiments.

Keywords Wuling powder; Network pharmacology; Chronic renal failure; Target; Mechanism of function

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.008

慢性肾衰竭（Chronic Renal Failure，CRF）为多种临床肾脏病持续进展的最终结果，是以水、电解质紊乱，酸碱代谢失衡及多系统症状为主要表现的一种临床综合征[1]。21世纪以来，CRF流行病学研究已成为全球肾脏病研究热点，据调查研究，中国东部沿海地区CRF患病率为11%～13%，而知晓率不足10%[2]。在此基础上，针对终末期肾衰竭的替代治疗（透析、肾移植）则会因其高昂的治疗费用造成社会负担和经济压力。

中医药凭借其独特的辨证论治体系在治疗CRF方面具有良好的效果[3]。慢性肾衰竭在中医学中归属于“关格”“隆闭”“水肿”等范畴，其基本病机为脾肾衰惫，气化不利，湿浊毒邪气内蕴三焦。病理性质多属本虚标实，治宜温补脾肾，祛湿化浊[4]。五苓散来源于东汉张仲景所著《伤寒杂病论》，用于治疗太阳表邪未解，内传太阳之腑，遂成太阳表里同病之蓄水证。原方泽泻为君、臣以猪苓、茯苓，并佐以白術、桂枝共同构成。泽泻善于治疗水肿、小便不利，下焦湿热者尤宜，《本草新编》有云：“入太阳、少阳足经，能入肾，长于利水，去阴汗，利小便如神，除湿去渴之仙丹也。”方中泽泻用量独重，故为君药;猪苓、茯苓甘补淡渗，长于利水，而无明显寒热之偏性，可应对虚实寒热等多种类型之水肿，二苓合用共为臣药;白术性苦、甘、温，功能燥湿利水，健脾益气，长于治疗脾虚水停而致的水肿、小便不利;外加桂枝甘温，助阳化气行水，温通经脉;诸药合用则可利水渗湿，化气解表，故蓄水留饮诸症自除[5]。有研究表明，五苓散具有保护肾脏、改善肾功能的作用[6]。但五苓散治疗CRF的作用机制有待进一步研究。

网络药理学是以系统生物学理论和多向药理学为基础的新兴学科，具有系统性和整体性的特点，能够以可视化角度清晰、直观地表达药物成分与疾病靶基因的联系，尤其与中药复方多成分-多靶点-多途径的特点有良好的适应性。本研究运用网络药理学的方法，通过构建“药物-成分-靶点-信号通路”来研究五苓散治疗CRF的作用机制。

1 资料与方法

1.1 五苓散活性成分的收集与筛选 分别以“猪苓”“茯苓”“泽泻”“白术”“桂枝”为关键词，采用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）进行检索，获得相应活性成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18作为筛选条件进行筛选，从而构建五苓散药物靶点集合。

1.2 药物与疾病靶点的预测与初步排查

1.2.1 根据PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到已筛选出的药物靶点SMILE式，并将活性成分对应的SMILE式输入SIB数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/），条件限定为Homosapiens，得到其作用靶点，去除重复项后，构建五苓散潜在靶点集合。

1.2.2 利用GeneCards数据库（http：//www.genecards.org/）以“Chronic Renal Failure”为关键词查找分析相关疾病基因，经整合处理，得到CRF疾病相关靶点。利用Omicshare（www.omicshare.com）将活性成分潜在靶点与CRF疾病靶点进行匹配，得到活性成分-CRF共同作用靶点作为治疗靶点，绘制韦恩图。

1.3 “五苓散-CRF”蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建 将匹配得到的五苓散-CRF治疗靶点导入STRING（https：//string-db.org/），以Homosapiens（智人）为标准确定物种条件，获得PPI关系，利用Cytoscape Version3.8.0进行可视化处理，并对相关靶点进行网络拓扑分析，据分析得出Averrage Node Degree值为26.2。将Degree值大于26.2作为筛选条件，得到核心靶点。

1.4 基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析 利用DAVID数据库（http：//www.david.niaid.nih.gov）对核心靶点分别进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析选择3个部分，分别是细胞组分（CC），分子功能（MF），生物过程（BP）。利用Omicshare（www.omicshare.com）工具对KEGG信号通路富集分析和GO富集分析绘制气泡图。

1.5 构建“药物-成分-靶点-信号通路”结构图 参照KEGG富集通路信息，设定P-value<0.05，Count值呈降序排列，筛选靠前的15条通路进行整合，将核心靶点与信号通路上富集的靶点相互匹配，取其交集得到富集靶点。最后导入CytoscapeVersion3.8.0绘制药物-成分-靶点-信号通路结构图。

2 结果

2.1 五苓散药物靶点的筛选 本研究以TCMSP平台共收集活性成分386个，其中猪苓31个，茯苓34个，泽泻46个，白术55个，桂枝220个。将OB≥30%、DL≥0.18作为筛选条件，同时剔除未找到靶点的活性成分，共获得活性成分30种，其中猪苓、茯苓共有的活性成分为Cerevisterol、Ergosta-7，22E-dien-3beta-ol，猪苓、桂枝共有的活性成分为Peroxyergosterol，泽泻、桂枝共有的活性成分为Sitosterol。见表1。

2.2 五苓散活性成分靶点基因及疾病基因预测 利用PubChem数据库得到活性成分对应的SMILE式，并将其输入SIB数据库，物种条件设定为人，经筛选整合后得到532个活性成分靶点;以“Chronic Renal Failure”为关键词在GeneCards数据库中进行检索，慢性肾衰竭相关靶点基因共7 820个，根据Relevance Score值呈降序排列，选取前981个作为疾病靶点。将981个疾病靶点与532个活性成分靶点取交集，共得到112个共同靶点作为治疗靶点。见图1。

2.3 “五苓散-CRF”PPI网络的形成与探究 通过STRING数据库，将112个治疗靶点导入后得到获得PPI网络，将其导入Cytoscape Version3.8.0进行可视化处理。得到112个节点（靶点）和1 466条边（靶点之间的相互作用），节点的Degree值与其颜色、大小成正比。取Degree大于Average Node Degree值即26.2的44个靶点作为核心靶点。得到白细胞介素6（IL6）、血清清蛋白（ALB）、表皮生长因子受体（EGFR）、肿瘤坏死因子（TNF）等靶点，此类靶点与CRF的进展有较高的相关性，可能对于治疗疾病具有重要意义。见图2。

2.4 GO富集分析和KEGG富集分析 GO富集分析利用DAVID数据库对44个核心靶点进行富集分析，取P<0.05，并以Count值降序排列筛选出前15位GO条目。GO富集分析分别从生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）3个方面进行分析。其中关联生物过程主要包括细胞凋亡过程、磷酸盐代谢过程及细胞增殖的正向调控;细胞组分主要涉及质膜、胞质溶胶、细胞器内腔;分子功能中主要涉及ATP结合、腺苷核糖核苷酸结合、嘌呤核苷结合等。

KEGG富集分析KEGG通路富集的靶点主要与Toll样受体信号通路、MAPK信号通路及T细胞样受体信号通路。见图3。

2.5 构建五苓散治疗CRF“药物-成分-靶点-信号通路”网络图 筛选KEGG信号通路富集排名前15的信号通路，并收集其对应的靶点与核心靶点取交集，得到富集靶点31个。见表2。整合绘制为最终的“药物-成分-靶点-信号通路”网络图。其中涉及的靶点主要包括白细胞介素6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNF）、表皮生长因子受体（EGFR）等。图中菱形代表药物，椭圆代表活性成分，矩形代表靶点，四边形代表信号通路。见图4。

3 讨论

五苓散收录于《中华人民共和国药典》2010版，列入《中国国家基本药物名录》。在我国，五苓散用于治疗肾炎、尿道损伤引起的排尿困难和水肿已有数百年的历史。有研究表明，五苓散对于高尿酸血症、糖尿病肾病、肝硬化腹水具有良好的疗效[7-9]，但其在治疗慢性肾衰竭中的作用尚未完全揭示。

慢性肾衰竭病理上常表现为肾小球硬化伴随大量细胞外基质的积累，肾小球周围区域和肾间质均显示纤维。多种原发性肾脏疾病均可引起CRF。大量证据表明，炎症在肾纤维化的发生和发展中起着关键作用[10]。首先，炎症对肾脏损伤提供了最初的保护性反应，其试图消除病因并促进恢复，但未解决的炎症会促进炎症-纤维化反应（Inflammation Fibrosis）。具体表现为炎症激活免疫系统细胞及固有肾脏细胞从而产生的炎症细胞浸润及炎症介质释放，最终导致成纤维细胞的活化及细胞外基质的沉积，促成肾脏的纤维化。在这一过程中，巨噬细胞具有重要作用，其与α-平滑肌肌动蛋白共生，能够引起炎症反应和增加肾小球基质沉积，具体包括了巨噬细胞基于IFN-γ、脂多糖的M1广泛促炎经典激活，以及基于免疫复合物诱导的促进纤维化和伤口愈合的M2交替激活[11]。对于原发病解除，肾脏損伤消退的研究，如急性缺血-再灌注的损伤，已证明巨噬细胞具有保护和恢复作用。因此，找出控制炎症反应相关的治疗靶点将有助于开发有效的方法来预防和阻止肾衰竭的进展。

本研究在药物-成分-靶点-信号通路中得到五苓散关键活性成分为啤酒甾醇（Cerevisterol），β谷甾醇（β-sitosterol），泽泻醇（Alisol B）等。研究表明，啤酒甾醇（Cerevisterol）可降低促炎症介质（例如TNF-α，IL-6和IL-1β）的表达[12]。此外，啤酒甾醇通过阻断抑制性蛋白κBα的磷酸化并抑核因子κB（NF-κB）的转录;β-谷甾醇均为甾醇类提取物，有研究表明，在β-谷甾醇是否对动脉瘤的生长具有抑制作用的实验中，与对照组大鼠比较，用β-谷固醇治疗的大鼠动脉瘤大小明显减少[13]。此外，β-谷甾醇的给药降低了趋化因子和包括TNF-α、IL-6在内的炎症介质的表达，β-谷甾醇给药的大鼠中炎症介质的水平显著降低，炎症部位募集的细胞数量减少;泽泻醇（Alisol B）23-acetate（AB23A）是一种三萜类化合物，是从泽泻根茎中提取，具有抗炎活性。实验证明，在脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激的小鼠模型中，泽泻醇提高了存活率并改善了心肌损伤，减少了炎症细胞浸润以及IL-6，IL-1β和TNF-α的水平[14]。此外，泽泻醇在体内和体外均抑制TLR4和NOX2的水平以及P38和ERK的激活水平;而根据PPI网络分析，治疗慢性肾衰的关键靶点包括TNF、IL6、MAPK等，这与五苓散主要活性成分功能相符合。其中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是巨噬细胞/单核细胞在炎症过程中产生的炎症介质，负责细胞内各种信号转导事件，导致坏死或凋亡。该蛋白质对于炎症-纤维化反应也很重要。在临床和实验中，巨噬细胞采用M1经典激活产生广泛促炎时，激活包括TNF-α在内的多种炎症介质，从而诱导更多白细胞群体的募集[15]。但当系统阻断TNF-α及其衍生因子时，肾脏损伤明显改善。此外，TNF-α在固有肾细胞的损伤如足细胞、肾小管上皮细胞，以及血浆补体蛋白的泄露导致的补体系统激活过程中有明显的表达。这既证明了TNF-α作为炎症和纤维化间关键环节的重要性，同时说明中药治疗慢性肾衰竭具有多靶点、多途径的特点和优势;白细胞介素6（IL6）是通过对感染和组织损伤的响应而迅速产生的，它通过激活急性期反应、造血作用和免疫反应来促进宿主防御。尽管它的表达受转录和转录后机制的严格控制，但是失调的IL6持续合成在慢性炎症和肾纤维化中起着病理作用，并广泛表达炎症反应与纤维化的全过程[16]。

根据KEGG富集通路筛选，五苓散调控的主要通路包括Toll样受体（Toll-like Receptor，TLR）、T细胞受体（T Cell Receptor，TCR）等。其中Toll样受体属于Ⅰ型跨膜蛋白受体，其广泛表达于小管上皮细胞、系膜细胞等肾脏固有细胞，是关联炎症与肾脏纤维化的重要因素，且为KEGG富集的关键通路。其能够通过NF-κB途径激活炎症介质使其大量释放而加速纤维化进程[17]。有研究表明，TLR4缺陷小鼠的TGF-β及纤连蛋白的表达明显减少，故阻断TLR4，抑制TLR/NF-κB信号通路，有利于抑制TNF-α、IL6、IFN-γ等炎症介质的活性，从而缓解肾脏纤维化的进程[18];T淋巴细胞来源于多能干细胞，能够响应TCR和常见的γ链细胞因子受体信号转导而诱导巨噬细胞吞噬，且TCR为KEGG所富集的关键通路，T细胞在肾组织内激活可产生趋化因子和免疫因子，诱导单核细胞募集并放大炎症作用，尤其在抗体产生及抗体依赖性肾小球损伤中的作用更为明显。有研究表明，在单侧输尿管梗阻实验（UUO）中明确了T细胞在促进间质纤维化的作用。而抑制T Cell Receptor通路对于抗肾脏纤维化、保护肾功能具有重要作用[19]。

综上所述，本研究通过网络药理学的手段挖掘、阐述了五苓散的活性成分、组方规律以及对于慢性肾衰竭治疗的多成分-多靶点-多途径的机制，初步推断五苓散可能通过调节TLR/NF-κB、T cell receptor等信号通路，抑制TNF-α、IL6等相关炎症介质活性从而延缓慢性肾衰竭[20]。可为之后进行的临床试验提供参考。然而慢性肾衰竭及肾脏纤维化的机制复杂，涉及的大量的信号通路及靶点，因此本研究所得到的结果仍应广泛付诸实验研究以期为临床治疗慢性肾衰竭提供更为明确的理论参考[21]。

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（2021-01-04收稿 责任编辑：魏庆双）