17β-雌二醇对髁突软骨细胞增殖的影响机制

张帅 王江红 田利杰 王宝利 张娟

1.天津医科大学口腔医院修复科，天津300070；2.天津医科大学朱宪彝纪念医院·内分泌研究所，天津300134

颞下颌关节骨关节病（temporomandibular joint osteoarthritis，TMJOA） 作为一种退行性关节疾病，其特征是软骨成分的退变以及软骨下骨的异常改建[1]。TMJOA 的发病人群主要集中于女性，影像学表现为髁突表面磨损变平或变尖、骨赘形成、囊样变等，髁突表面软骨细胞死亡，软骨基质降解是造成TMJOA的重要原因之一[2-3]。

由于女性易患TMJOA，雌激素在TMJOA 发生发展过程中的作用引起关注。在自然TMJOA 模型中，17β-雌二醇（17β-estradiol，E2） 的应用能有效缓解关节软骨退变，表明E2 对关节软骨存在保护作用，然而该保护作用机制尚未明确[4-5]。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR） 广泛存在于各种细胞中，在细胞自噬活动中发挥重要调节作用。mTOR 通过磷酸化能够活化并能有效抑制自噬关键标志物脂质化轻链蛋白3B （lipid modified of light chain 3B，LC3-Ⅱ） 的形成，从而抑制细胞自噬。近期研究[6]表明，mTOR 信号在细胞生长增殖过程中也起到重要作用。

雷帕霉素（rapamycin，RAPA） 是一种自噬诱导剂，也是特异性mTOR抑制剂，可以抑制mTOR的磷酸化。研究[7]表明，颞下颌关节损伤模型中的软骨退变会伴有软骨内自噬水平的降低，而RAPA的应用可以特异性提高软骨内自噬水平，提高软骨细胞抗损伤能力并延缓关节软骨的退变进程。

本实验通过检测E2 在不同条件下对髁突软骨细胞增殖及自噬相关指标的影响，来探讨E2 影响髁突软骨细胞增殖能力的机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

6 周龄雌性SD 大鼠20 只（北京斯贝福公司），动物使用符合我国关于动物保护管理委员会相关规定。

1.2 主要试剂

总RNA 快速提取试剂盒（Omega 公司，美国），高效率逆转录试剂盒（Thermo公司，美国），SP-9000 试剂盒（上海生工生物工程有限公司），无酚红培养基（天津可典生物科技有限公司），雌激素受体α （estrogen receptor alpha，ERα） 单克隆抗体（Abcam 公司，英国），β-actin 单克隆抗体、雌激素受体β （estrogen receptor beta，ERβ） 单克隆抗体、LC3-Ⅱ单克隆抗体（Proteintech公司，美国），E2、RAPA、ERβ 拮抗剂PHTPP、ERα 拮抗剂AZD9496 （MCE 公司，美国），磷酸化雷帕霉素哺乳动物靶标（phosphorylate-mammalian target of rapamycin，p-mTOR） 单克隆抗体（CST 公司，美国）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠髁突软骨细胞的分离和培养 取大鼠髁突软骨，剪碎后于15 mL离心管中以0.25% 胰酶消化30 min，终止消化后离心弃去上清液，以0.2%Ⅱ型胶原酶消化5 h 后，接种到含20% 胎牛血清和1% 双抗的无酚红高糖DMEM 培养基中，于37 ℃，5%CO2细胞培养箱中培养，每3 d 进行换液。后续实验以含10% 胎牛血清和1% 双抗的无酚红高糖DMEM 培养基进行细胞培养。细胞传代使用胰蛋白酶消化贴壁细胞，DMEM 终止消化并接种于培养皿中，次日换液。

1.3.2 软骨细胞的观察和鉴定 运用倒置显微镜观察并分析各代髁突软骨细胞形态、胞间连接及胞膜表面是否出现细胞突起。取第3代细胞进行Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色，取6孔板圆形空白细胞爬片置于100 mm 培养皿中，设置3 个重复板，滴加细胞悬液并没过爬片，放入细胞培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，以4% 多聚甲醛固定20 min，PBS冲洗后于0.5% TritonX-100中室温孵育20 min，按照SP-9000试剂盒说明进行染色，并孵育Ⅱ型胶原一抗稀释液，于4 ℃环境下过夜，次日依次加入生物素标记山羊抗兔IgG及辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育，使用DAB/AEC 显色液，室温孵育5～8 min 后行复染，梯度乙醇脱水封片，显微镜下观察，判读，观察细胞胞浆染色变化，深染为阳性改变，如无深染则为阴性改变，对照组细胞使用成纤维细胞。

1.3.3 髁突软骨细胞的实验分组 第一部分实验：E2 对髁突软骨细胞增殖及自噬的影响。将第二代髁突软骨细胞分为4组：空白对照组（培养基中仅含等浓度DMSO）、10-6mol·L-1E2 组（实验组1）、10-8mol·L-1E2 组（实验组2）、10-10mol·L-1E2 组（实验组3）。

第二部分实验：E2 及RAPA 共同作用对髁突软骨细胞增殖及自噬的影响。将第二代髁突软骨细胞分为8组：空白对照组（培养基中仅含等浓度DMSO）、10-6mol·L-1E2组（实验组1）、10-8mol·L-1E2 组（实验组2）、10-10mol·L-1E2 组（实验组3）、10-9mol·L-1RAPA 组（实验组4）、10-6mol·L-1E2+10-9mol·L-1RAPA 组（实验组5）、10-8mol·L-1E2+10-9mol·L-1RAPA组（实验组6）、10-10mol·L-1E2+10-9mol·L-1RAPA组（实验组7）。

第三部分实验：E2、RAPA 及ERα 拮抗剂AZD9496 或ERβ 拮抗剂PHTPP 共同作用对髁突软骨细胞p-mTOR表达的影响。将第二代髁突软骨细胞分为6组：空白对照组（培养基中仅含等浓度DMSO）、10-9mol·L-1RAPA组（实验组1）、10-8mol·L-1E2 组（实验组2）、10-8mol·L-1E2+10-9mol·L-1RAPA 组（实验组3）、10-8mol·L-1E2+10-6mol·L-1AZD9496 组（实验组4）、10-8mol·L-1E2+10-6mol·L-1PHTPP组（实验组5）。

1.3.4 CCK8 实验 第一部分实验和第二部分实验进行CCK8 实验。取第二代髁突软骨细胞以每孔2×103个的密度进行铺板（96 孔板），次日换液给药，分组按照上述第一部分和第二部分实验分组执行，每组设置6 个复孔，实验重复3 次；培养时间分为24、48、72 h。于各培养时间点换液后每孔加入10 μL CCK8 溶液，置于37 ℃，5%CO2培养箱中孵育2 h；处理结束后于全波长扫描酶标仪（BioTek公司，美国） 在波长450 nm下测定各孔光密度（optical density，OD） 值。

1.3.5 逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR） 检测髁突软骨细胞自噬及增殖相关基因表达 第一部分实验进行RT-PCR 实验。取第二代髁突软骨细胞以每孔2×104个的密度进行铺板（24 孔板），次日换液给药，分组按照上述第一部分实验分组执行，每组设置3个复孔，实验重复3次；培养第48小时收集细胞。总RNA 快速提取试剂盒提取细胞总RNA；高效率逆转录试剂盒进行细胞总RNA 逆转录；2×SYBN Green qPCR Kit （上海生工生物工程有限公司） 检测ERα、ERβ、Ⅱ型胶原（collagen type Ⅱ，COLⅡ）、自噬相关基因6 （autophagy-related gene 6，ATG-6/Beclin-1）、自噬相关基因5 （autophagyrelated gene 5，ATG-5） 基因表达水平；以β-actin作为内部参照基因，采用2-ΔΔCT法进行统计。本实验所采用的RT-PCR引物序列见表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.3.6 蛋白印迹（Western blot） 检测髁突软骨细胞自噬及增殖相关蛋白表达 各部分实验均进行Western blot 实验。取第二代髁突软骨细胞以每孔2×105个的密度进行铺板（6 孔板），次日换液给药，分别按照以上对应实验部分进行分组，每组设置3 个复孔，实验重复3 次；第一部分实验于培养24、48、72 h 后收集细胞；第二、三部分实验于培养48 h后收集细胞。RIPA裂解细胞提取蛋白；BCA 法测定蛋白浓度；十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE） 法分离蛋白；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF） 膜转膜；5% 牛奶室温封闭1 h 后加入一抗液（ERα、ERβ、Beclin-1、LC3-Ⅱ、p-mTOR，1∶1 000 稀释） 于4 ℃环境下孵育过夜；次日，TBST 荡洗5次，随后加入二抗液（HRP 标记的山羊抗兔IgG，3∶1 000 稀释、HRP 标记的山羊抗小鼠IgG，1∶1 000 稀释） 室温孵育2 h；TBST 荡洗3 次后采用电化学发光（electrochemiluminescence，ECL） 液显影，Image-J分析条带灰度值，计算相对表达量。

1.4 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，对所测结果进行正态性及方差齐性检验，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。当P＜0.05 时认为实验数据差异有统计学意义。

2 结果

2.1 髁突软骨细胞的培养和鉴定

接种后，原代细胞表现为较小的三角形形态，散在分布；第一代到第三代软骨细胞表现为典型“铺石路” 样，且生长较快，胞核明显，状态较好；第五代到第七代软骨细胞可见成纤维样细胞成分开始有所增加，但主体仍为软骨细胞，生长状态较好；第九代软骨细胞中，细胞形态全部转化为成纤维型，并有多个突起，增殖能力显著下降（图1A）。第三代软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色后，可见软骨细胞胞浆呈棕褐色改变，显示为阳性变化；非软骨细胞胞浆无深染，呈阴性变化（图1B）。

图1 髁突软骨细胞形态及其Ⅱ型胶原免疫组织化学染色Fig 1 The morphology and immunohistochemical staining of type Ⅱcollagen of condylar chondrocytes

2.2 髁突软骨细胞在不同浓度E2 作用下的增殖变化

不同E2 浓度下，检测软骨细胞在给药后24、48、72 h 的增殖水平（图2）。由图2 可见，给予E2 后，髁突软骨细胞的增殖速度显著加快，并存在明显的中间最优浓度及双向性作用，表现为在E2 浓度为10-8mol·L-1时，髁突软骨细胞增殖最快（P＜0.05），而低于或高于该浓度会不同程度地降低E2 对髁突软骨细胞增殖的促进作用。同时各组细胞数量均在第48 小时达到顶峰，在第72 小时达到平台期并发生下降。

图2 E2对髁突软骨细胞增殖的影响Fig 2 The effect of E2 on the proliferation of condylar chondrocytes

2.3 E2 对髁突软骨细胞增殖、自噬相关靶标表达的影响

RT-PCR 结果显示在培养第48小时，各组细胞中ERα 和ColⅡ的基因表达水平随E2 浓度的增加而先升高后降低，呈现 “倒V 形”，并在浓度为10-8mol·L-1时达到峰值（P＜0.01），ERβ 的基因水平则无明显变化。同时，Beclin-1 和ATG-5 的基因水平在低浓度E2处理组（10-10、10-8mol·L-1） 中显著低于对照组（P＜0.05）（图3A～E）。

Western blot实验结果与RT-PCR实验结果趋于相同，如图3F 所示，在培养第48 小时，与空白对照组相比，E2 处理组中p-mTOR 表达显著升高，Beclin-1 和LC3-Ⅱ表达降低，其中p-mTOR 蛋白在10-8mol·L-1E2 组中表达量最高（P＜0.05）；同时，在10-8mol·L-1E2 组中，ERα 表达量达到最高（P＜0.05），ERβ的表达则没有明显变化（P＞0.05）。

10-8mol·L-1E2 组在第24、48、72 小时各蛋白表达量的表达结果见图3G。在第48 小时，细胞中p-mTOR 和ERα 的表达量最高，高于第24、72 小时相应蛋白表达量（P＜0.05）；在第72小时，相较于第24、48小时，细胞中Beclin-1、LC3-Ⅱ、ERβ的表达量明显升高，p-mTOR和ERα的水平显著下降（P＜0.05）。

图3 E2对髁突软骨细胞增殖、自噬相关靶标表达的影响Fig 3 The effects of E2 on the expression of targets related to proliferation and autophagy of condylar chondrocytes

2.4 p-mTOR 在E2 促进髁突软骨细胞增殖中的作用

为验证E2 对髁突软骨细胞增殖的促进作用是否涉及p-mTOR，实验中应用mTOR 特异性抑制剂RAPA，结果见图4A～C，CCK8实验结果表明，用RAPA 处理髁突软骨细胞后，在各培养时间点，细胞增殖水平均显著低于单纯E2组（P＜0.05）。Western blot 实验结果显示，RAPA 能够抑制对照组和实验组细胞中p-mTOR 的表达，促进Beclin-1 和LC3-Ⅱ的表达（P＜0.01），但对ERα 和ERβ 表达的影响不具有统计学意义（P＞0.05）（图4D）。

图4 RAPA对E2促进髁突软骨细胞增殖的影响Fig 4 The effect of RAPA on the proliferation ability of condylar chondrocytes with different E2 levels

2.5 雌激素受体抑制剂对E2 作用下髁突软骨细胞中p-mTOR蛋白表达的影响

在10-8mol·L-1E2 处理组中， 加入AZD9496后，软骨细胞中p-mTOR的表达明显降低，接近对照组水平（P＜0.01），而加入PHTPP 后，与单纯10-8mol·L-1E2处理组相比，p-mTOR的表达差异无统计学意义（P＞0.05）（图5）。

图5 雌激素受体抑制剂对各组软骨细胞中p-mTOR蛋白表达的影响Fig 5 The effect of estrogen receptor inhibitors on the p-mTOR expression of chondrocytes

3 讨论

TMJOA 是一种发生于软骨和软骨下骨的渐进性退行性疾病，软骨的退变核心在于软骨细胞的死亡以及软骨基质的降解破坏。既往研究表明，E2的应用能有效缓解关节软骨退变[4-5]，对体外培养的髁突软骨细胞起到双向调节作用（低浓度促进细胞增殖，高浓度抑制细胞增殖），并在10-8mol·L-1浓度下对体外培养的人胚或兔髁突软骨细胞具有最显著的促增殖作用[8]。在本实验中，10-10、10-8mol·L-1E2 处理后的大鼠髁突软骨细胞增殖活力明显高于对照组，也验证了E2 对髁突软骨细胞具有促增殖作用。然而E2 对髁突软骨细胞的作用机制尚未明确。

自噬是一种细胞内部调节过程，起到双向作用。一方面，自噬是一种细胞在应激状态下的适应性反应，促进细胞存活；另一方面，过度自噬会引发Ⅱ型程序性细胞死亡，参与疾病的发生发展。mTOR 信号分子是细胞中广泛存在的调节因子，在细胞自噬及增殖活动中发挥重要作用[7]。髁突软骨作为下颌骨生长发育及负重中心[9]，其细胞中mTOR 的作用机制可能更加复杂。既往研究[10]表明，mTOR 的磷酸化状态受到抑制后，细胞会激活本体自噬反应，并可观察到细胞生长速度减缓。因此本研究旨在探讨自噬反应是否参与了E2对髁突软骨细胞增殖活动的调节。

以往相关研究发现，E2作用于不同细胞系后，细胞中的自噬反应变化不同[11-12]，有结果显示E2可以促进人永生化软骨细胞系p-mTOR表达，抑制其自噬活动[11]；而同样有结果显示E2 作用于人子宫内膜癌细胞后会抑制细胞中p-mTOR表达，促进其自噬活动[12]。本研究中Western blot 结果显示，在E2 处理的髁突软骨细胞中，p-mTOR 表达量升高，Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达量降低，细胞自噬受到抑制，并且这种变化呈现出剂量依赖性的特点，表现为当E2 浓度为10-8mol·L-1时，p-mTOR 升高最明显，而高于或低于该浓度，p-mTOR的水平都会相对降低，提示E2 对细胞增殖活动的调节中可能涉及p-mTOR分子。

RAPA 是一种特异性mTOR 抑制剂及自噬诱导剂，可特异性抑制mTOR 的磷酸化修饰[13]。本实验中，RAPA 的应用显著降低了细胞中p-mTOR 水平，并降低了细胞增殖活性，这可能是由细胞自噬活动增强，自身相对稳态增加，同时抑制自身有丝分裂活动所导致的[13]。该结果进一步验证mTOR 的磷酸化形式在细胞增殖过程中具有重要作用。而RAPA对关节损伤模型中软骨的保护作用可能是通过促进软骨细胞自噬活动，将更多蛋白质用以修复细胞损伤而实现的，从而能够延缓关节软骨退变进程。

大量早期实验均提及到E2 主要通过两大核受体ERα、ERβ发挥其生物学效能，如调节细胞凋亡等[14]。在本研究中，ERα在软骨细胞中的表达随着E2 处理浓度的升高而变化，并在10-8mol·L-1的浓度下达到峰值，并与细胞中p-mTOR水平呈现出明显正相关性，此外，p-mTOR和ERα的表达量变化也呈现出与培养时间相关的一致性，表现为在第48 小时，p-mTOR 和ERα 蛋白表达量最高，并与该浓度下，细胞的增殖变化趋势一致。表明E2 可能通过ERα 激活mTOR 并发挥作用。为验证E2 是否通过雌激素受体进而调节mTOR 的磷酸化修饰，实验中应用了ERα 拮抗剂AZD9496 和ERβ 拮抗剂PHTPP，结果显示，当应用AZD9496 后，细胞中mTOR 的磷酸化水平明显降低，并接近对照组水平；而应用PHTPP 后，细胞中p-mTOR 水平未有明显变化。说明E2 至少可以通过ERα 而非ERβ 改变细胞中p-mTOR水平并进而影响细胞增殖活力。

以上研究表明，E2 可以通过ERα-p-mTOR 通路抑制细胞自噬，促进细胞增殖，提示E2-ERα-pmTOR 通路在TMJOA 的发生发展中可能发挥作用。值得注意的是，本实验在第一阶段（雌激素处理阶段），发现在E2 处理后第48 小时，高浓度E2 （10-6mol·L-1） 条件下，细胞中自噬相关标志物在基因水平上高于对照组，但在蛋白水平上低于对照组，提示高浓度E2 对髁突软骨细胞中自噬的调节可能存在时效性及双向性作用，即初期抑制细胞自噬，后期促进细胞自噬。并且，Xiang 等[15]研究表明E2 对乳腺癌细胞自噬的调节确实存在双向性作用，能够将细胞中自噬水平维持在一个稳定的范围内，而自噬水平的失衡可能会导致细胞增殖活性的改变；此外，何磊等[12]实验中用于处理细胞的E2 浓度远超10-6mol·L-1，而结果显示该条件下，细胞的自噬作用增强，这些结果均说明不同浓度E2 对同种细胞或不同细胞的效应具有差别，甚至作用相反。因此，关于高浓度E2 对于髁突软骨细胞中p-mTOR及自噬的调节机制和意义尚需进一步研究。

综上所述，本实验阐明在10-8mol·L-1E2 条件下，E2 能通过ERα 途径促进p-mTOR 的表达，并在体外培养的髁突软骨细胞增殖活动中发挥正向调节作用，该研究或可为探究E2 与TMJOA 之间的关系提供一个新的思考方向，然而鉴于本实验所采用的E2 浓度的局限性以及体外细胞实验具有的偏差性，E2 与p-mTOR 和细胞或组织之间的具体作用机制还需进一步研究。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。