宏基因组二代测序在脓毒症病原学诊断中的临床应用*

陈友莲，刘雪燕，陈怀生，洪澄英，刘晓君

(深圳市人民医院重症医学科，广东 深圳 518020)

脓毒症(sepsis)是一种复杂的临床综合征，表现为宿主对感染的反应失衡，与急性器官功能障碍和高死亡风险相关[1]。 在中国，每年约有102.6 万例患者死于脓毒症相关性疾病，占世界脓毒症总死亡人数的 19.4%[2]。近年来，随着脓毒症诊断及治疗方法的进步，院内患者死亡率虽总体呈降低趋势[3]，但其发生率却持续升高[4]。目前，脓毒症病原学诊断主要包括培养(以细菌和真菌为主)、血清免疫学检测等。其中，血液培养(BC)被认为是诊断脓毒症病原学的“金标准”，但BC周期较长(3～7 d)，诊断阳性率较低，且并非所有的病原体都能被培养出，使得BC具有明显的局限性[5]。血清免疫学检查也只能检测几种特定病原体，显然不能满足临床需要[6]。 宏基因组二代测序(mNGS)是一种新的病原学检测方法，其直接从感染样本中提取所有微生物核酸进行高通量测序，具有检测速度快、准确率高、覆盖范围广等特点，在临床病原学诊断和医学研究领域显示出良好的应用前景[7]。 本研究对血标本mNGS与BC2种病原学检测方法检测脓毒症患者病原体检出率、检测耗时及临床结局等指标进行比较，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019 年1 月至 2021 年1月本院重症医学科(ICU)收治的60例脓毒症患者作为研究对象。纳入标准:(1)临床诊断为脓毒症[8]； (2)首次入住ICU，48 h内行BC及mNGS检测；(3) 患者或授权家属知情且同意进行mNGS检测。 排除标准:(1)合并晚期恶性肿瘤；(2)近半年内接受过免疫抑制剂治疗；(3) 妊娠和18岁以下。本研究为回顾性研究，患者记录数据编码后匿名以保护患者的隐私，符合医学伦理学原则。本研究获得本院医学伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1研究方法 符合纳入标准患者进入 ICU 后，在静脉应用抗菌药物抗感染前，严格按照采血流程及规范，常规采集双上肢静脉血各 10 mL 保存于需氧与厌氧BC瓶中进行微生物培养，同时另采集5～10 mL全血样本，并将其储存在4 ℃的EDTA管中，由专业人员及时送往深圳华大基因研究所进行mNGS检测。依据患者临床表现、实验室资料及影像学等资料，经主治医生综合评估后给予脓毒症集束化治疗(原发病治疗、液体复苏、呼吸循环支持、营养支持、控制血糖、预防应激性溃疡、血栓预防等)。根据BC及 mNGS 检测结果，结合临床实际情况决定是否调整抗感染药物。患者在ICU治疗结局包括：死亡、治愈出院或好转后转入其他专科。

1.2.2观察指标及评价标准 统计BC及mNGS检测病原体例数、检出种类、检测耗时( 检测耗时是指从采集样本到出具病原体报告的时间)、疾病严重程度评估、感染部位分布、器官支持治疗措施、抗生素调整及治疗转归。

2 结 果

2.1患者基本特征 60例接受BC和mNGS检测患者基线资料见表1。mNGS阳性组及BC阳性组患者在人口学特征、疾病严重程度、主要诊断比例等方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。60例患者中男 33 例，女 27 例；年龄21～72岁，平均(53.58±17.43)岁；住院时间5～33 d，平均(18.55±14.38) d。感染包括肺部感染12例(20.00%)、腹腔感染30例(50.00%)、泌尿系感染10例(16.70%)、导管相关性感染 5 例(8.30%)及其他感染3例(5.00%)。呼吸机支持占比75.00%，血液净化支持占比58.30%。mNGS检测耗时较BC短，差异有统计学意义(P>0.05)。所有患者均有抗生素使用史，因病原体检测结果调整抗生素，mNGS占比26.67%，BC占比16.67%，差异有统计学意义(P<0.05)。此外，mNGS阳性组住院时间较BC阳性组短，差异有统计学意义(P<0.05)，但两组28 d死亡率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 60例患者基线特征及治疗转归情况

2.2病原体分布情况 病原体分布见图1，mNGS检测病原体中67.4%为革兰阴性菌，20.9%为革兰阳性菌，11.2%为真菌。而BC检测病原体中70.6%为革兰阴性菌，11.8%为革兰氏阳性菌，17.6%为真菌。2种方法检测出细菌分布相似，排在首位的是鲍曼不动杆菌，其次是铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌。最常见的真菌感染是念珠菌，其次是曲霉菌。值得注意的是，在17例患者中mNGS检测到5种病毒，最常见的是巨细胞病毒(CMV)5例和Epstein Barr病毒5例，其他还包括疱疹病毒3例、细环病毒3例、人类细小病毒B19有1例。

2.3mNGS和BC病原学检测效能比较 在60例患者检测标本中，mNGS检测阳性27例(45.00%)，BC检测阳性17例(28.33%)，二者均阳性15例(25.00%)，均阴性31例(51.67%)，其中mNGS阳性而BC阴性12例(20.00%)，BC阳性而mNGS阴性2例(3.33%)。mNGS病原体阳性检出率明显高于BC，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表2。

图1 mNGS和BC鉴定的病原菌分布

mNGSBC阳性阴性合计阳性15(25.00)12(20.00)27(45.00)阴性2(3.33)31(51.67)33(55.00)合计17(28.33)43(71.67)60(100.00)

3 讨 论

脓毒症是困扰重症医学的主要问题之一，其发病率和死亡率仍然居高不下[9],给社会带来了巨大的经济负担[10]。早期识别致病病原体和及时、精准地使用合适的抗生素是影响患者预后的关键，特别是在脓毒症诊断后1 h内使用[11]。然而，目前的大多数方法都是经验性的治疗，因为在临床实践中很难及时发现致病病原体。目前临床上仍是依靠培养技术来确定病原体，但是，该方法存在着许多不足，如培养鉴定时间较长、阳性率低、部分病原体难以被培养出等[12]。

mNGS是一种广泛的测序方法，其可以对临床或环境样本的所有基因组[DNA和(或)RNA]进行测序。这种技术可借助从标本中检测到的病原体DNA片段基因序列判断出感染的致病微生物，检测灵敏度可以达百万分之一；不仅如此，此种方法可将病原体鉴定的时间大大缩短，据报道目前最快可在30 h内获得微生物体种类及耐药性的结果[13]。

与常规BC相比，mNGS具有如下优点：(1)血mNGS检测灵敏度明显提高，导致mNGS敏感度高的原因可能是由于病原体DNA在血浆中存活时间长，抗生素使用对mNGS结果影响较小，而传统BC受抗生素的使用影响较大；(2)病原学符合率高，本研究中只有2例BC阳性而mNGS阴性，病原菌为表皮葡萄球菌，分析原因可能系采血污染所致；(3)检测时间缩短，具有明显优势；因病原体明确，行抗生素调整占比26.67%，mNGS检测阳性组患者ICU住院时间明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05)；(4)虽然28 d生存率有改善，但与BC比较，差异无统计学意义(P>0.05)，这可能与影响脓毒症生存率原因复杂及病例数不足有关。此外，血mNGS在检测病毒方面具有非常明显优势，特别是对一些病毒导致肺炎患者具有重要诊断意义[14]。

但mNGS也存在局限性。首先，外周血 mNGS能灵敏地特异性检出病原体，也可能检出定植或非致病性的微生物，造成假阳性结果，这可能会导致不必要的检测和不适当的治疗[15]；其次，环境或人体菌群对微生物基因组的污染、质量控制、方法标准化和数据解释，更低的成本和测序时间及简化的解释标准也是目前面临问题[15]。这些缺点极大地限制了mNGS在病原学鉴定领域的临床应用。随着技术发展，相信在不久的将来这些问题都可以迎刃而解。

综上所述，mNGS在脓毒症患者病原学早期诊断中具有良好的应用前景。